拡散うつ病を使用してエピソードと慢性片頭痛の神経免疫シグナルのモデリングインビトロ

このビデオの目的は、海馬スライス培養を使用して、片頭痛の前兆やおそらく片頭痛の根本的な原因である可能性が最も高いうつ病の広がりに対する感受性を調節する神経免疫シグナル伝達を解読する方法を説明することです。うつ病の広がりは、海馬スライス培養で容易に引き起こされます。培養物はin vitroで数週間維持されるため、個々の細胞タイプの挙動を長期間にわたって測定、模倣、および調節することができます。

これは、神経免疫シグナル伝達の研究にとって特に重要です。成熟した海馬の脳切片は静止免疫状態に達するため、最新の分子生物学的技術を使用して、麻酔の潜在的に交絡する影響なしに、広がるうつ病の免疫応答を評価できます。それに応じて、スライス内のわずか50細胞から約90,000細胞までのサイトカインシグナル伝達の高感度検出を決定できます。

海馬脳切片培養は、片頭痛を緩和するための新規神経免疫療法の開発に理想的です。私の名前はイアン・バーグで、シカゴ大学医療センターのリチャード・クレイグと神経科の研究室のアヤ・プスとハイディ・ミッチェルです。今日は、ラットの海馬、シラミ、培養物の使用、および広がるうつ病の低レベルの免疫シグナル伝達の研究を示します。

うつ病の広がりは、シナプス活動の増加によって引き起こされ、その後すぐにすべての活動が一時的に失われることによって引き起こされる発作性の神経イベントです。低レベルの免疫シグナル伝達が脳内のシナプス活動に影響を与え、その見返りとして影響を受けることを示す証拠が増えています。私たちは、サイトカインがうつ病の広がりに対する感受性を調節し、その結果、片頭痛の前兆、そしておそらく片頭痛も

ここで説明する手順は、潜在的に交絡する可能性のある免疫細胞の活性化を最小限に抑え、低レベルの免疫シグナル伝達を検出する能力を高めるように設計されています。これにより、最も広範な神経免疫シグナル伝達と、その広がりうつとの相互作用を検出することができます。この手順を開始するには、ガラス管を4.5ミリメートルの長さに切断して接地電極を作成します。

次に、両端のカット部分を短くファイヤーポリッシュします。次に、1モルの塩化カリウム100ミリリットルを沸騰させ、3.5グラムの寒天と0.5グラムのEDTAを加えます。混合物を連続的に攪拌して、透明な黄色の溶液を生成します。

短いフレキシブルチューブを各ガラスチューブに取り付けます。次に、温かい塩化カリウム農業溶液をガラス管に引き込み、少し離れたところにフレキシブルチューブに引き込みます。吸引力を解放し、塩化カリウム寒天がガラス管の開いた先端からゆっくりと滴り落ちるのを待ちます。

寒天が滴り落ちたら、開いたガラス管の先端で氷に触れると、寒天がガラス管管に戻った後にゲル化するのではなく、電極の先端でゲル化するように促されます。寒天がゼリー状になったら、アグラの位置を変えずにフレキシブルチューブをそっと取り外します。ガラス管に、0.5ミリリットルの1モル塩化カリウムを1.5ミリリットルの遠心分離管ラックの各ウェルに入れます。

次に、各塩化カリウムアフィルガラス管の先端を個々のウェルに入れて、先端を湿らせます。次に、長さ80センチメートルの15ゲージの銀線を止血器で持ちます。カウンタートップに固定されたエメリーボードを通してワイヤーをこすり落とし、4つの側面のそれぞれを清掃します。

その後、ワイヤーを4センチの長さにカットします。漂白剤を充填したシンチレーションバイアルに20〜30分間入れます。洗浄した銀の表面に銀から塩化銀への固いコートを敷くには、ワイヤーを半分に曲げて、塩化カリウム寒天で満たされたガラス管に挿入し、約4〜6ミリメートル露出させます。

次に、銀線と少量のワイヤーを含むガラス管の先端に、塩化カリウム寒天が乾燥するのを防ぐための耐水性で柔軟な接着剤であるグープをコーティングし、すべての電極に対して繰り返し、接着剤を一晩乾燥させます。延伸後、電極を5ミリリットルの1モル塩化カリウムと25ミリグラムのEDTAを入れたシンチレーションバイアルに保管します。バイアルあたり約5〜6個の電極を摂氏4度で使用します。

フィラメント付きのホウケイ酸ガラス管で記録電極を作製します。次に、テフロンコーティングされたプラチナ子午線を約20センチメートルの長さにカットして刺激電極を作ります。次に、長さを半分に曲げ、緩い端を緩い四角い結び目に結び、結び目からワイヤーの端まで約2センチを残します。

テーブルの上に置かれた電動缶ドリルのチャックに結び目を固定し、ワイヤーのもう一方の端を止血器で保持します。ワイヤーがしっかりとねじれるまで、ドリルを短時間オン/オフします。白金子午線をリード線に取り付けるには、まず白金子午線をベンチトップにテープで固定し、撚り線の一方の自由端に濃塩酸の水たまりを落とします。

次に、剥がした端を撚り線端に隣接するリード線に置き、先端の細いはんだごてで熱を加え、2本の線がしっかりと取り付けられるまではんだ付けします。露出したワイヤ接続部に短い長さの熱収縮チューブを滑り込ませ、熱火で収縮させます。15cmのピペットの先端を磨き、ねじれたプラチナ子午線をピペットに導きます。

電極の両端をシールするために撥水エポキシを使用してください。最後に、リード線の端にバナナプラグを取り付けて、立体観察下の刺激アイソレータに接続します。電極チップをPBSに置き、撚り線の側面から気泡が出ている場合は、電極チップの切り口からのみ電解生成された気泡を探します。

シングルエッジカミソリの刃を使用して電極を横方向に切断し、ワイヤの長軸への絶縁を無傷で再確立します。異常刺激の影響を解決するためにトラブルシューティングを行うときは、切りたての電極チップを作成してみてください。もう1つの重要なステップは、スライス培養インサートと、約1.0cm間隔で約1.0mm間隔の2本の1.0 x 12mmガラス棒に座る35mm培養皿からなる記録皿を準備することです。

ガラス棒は、ガラス管を加熱し、鉗子でベースに押し込むことにより、皿ベースに取り付けられます。静的な記録条件の場合は、皿に1.5ミリリットルのメディアを追加します。これに続いて、幅10ミリメートル、長さ3〜4センチメートルの滅菌綿を浸します。

1.0ミリリットルのメディアで、綿を長軸に沿って半分に折り、インサートの内壁に沿って置きます。滅菌鉗子を使用すると、濡れた綿が皿の湿度を維持するのに役立ちます。長さ4mmの圧縮性チューブが3本、インサートの周囲に等間隔に配置されています。

ガス交換を可能にするために、皿をポリ塩化ビニルフィルムでしっかりと覆います。次に、その中央の垂直壁の周りを片刃のかみそりの刃で切り取り、余分なポリ塩化ビニルを取り除きます。フィルムは、0.2ヘルツで100マイクロ秒のパルスで約3つの電界電位を呼び起こし、応答をトリガーするのに十分な約1〜5マイクロアンペアの電流から始まります。

電界電位が最大になるまで、記録電極をパラメタルニューロンの長軸に沿って段階的に動かします。次に、この位置に記録電極で電流を増やし、最大電流応答が約10〜20マイクロアンペアであることに注目してください。最後に、実験に半値の最大刺激強度を使用して、トランスシナプスが誘発する広がるうつ病の閾値を決定します。

刺激パラダイムを切り替えて、10ヘルツでパルスあたり100マイクロ秒のシングルバーストを手動で呼び起こします。うつ病の広がりが引き起こされるまで、刺激バーストごとに電流強度を徐々に増やします。うつ病の閾値をラムに広げると、うつ病が9分ごとに1時間広がります。

約3つのエリアの高速電位と低速電位の変化を別々のデジタル信号処理システムを介して記録します。最後に広がるくぼみの後、培養インサートを通常のインキュベーション条件に戻し、培養皿の蓋に印を付けます。うつ病の蔓延を経験した文化に注意するには、培養収穫まで3〜4日ごとにメディアを交換します。

この手順は、成長培地でISOセレクチンを1ミリリットルあたり20マイクログラムに希釈することから始めます。次に、イメージングの4〜10時間前に通常のインキュベーション条件でスライス培養物をインキュベートし、イメージングの少なくとも1時間前に顕微鏡カメラ、UV光、温度制御、およびガスをオンにします。次に、この挿入物を35ミリメートル培養皿に配置し、底部に2本の1ミリメートルガラスロッドを配置した後、イメージング用のメタモルフソフトウェアを設定します。

次に、インサートの壁と培養皿の間に3本の2mmゴムチューブをはめ込みます。インサートをさらに安定させるには、幅10mmの綿をインサート内にさらに1mmのメディアに浸します。加湿環境を維持するために、培養皿の上部をポリ塩化ビニルフィルムでしっかりと覆います。

体液の損失を防ぐために、イメージングの焦点がCA 3パラメタルセル層にあることを確認してください。ファインフォーカスウィンドウで5 x 10 xと20 xでフェーズ写真を撮影し、範囲電流を8に、精度をワンクリックでフォーカスを見つけて、タイムラプスウィンドウでピントが合った画像を確保することで、スライスの向きに注意してください。時間間隔を 1 分、期間を 6 時間にして、ミクログリアの動きを正確にキャプチャします。

イメージングは、映画の最後に1分に1回以上の頻度で行う必要があります。PCR実験のためのCYトークスクリーニングによる細胞損傷の有無を確認します。スライス培養インサートを後で2〜3ミリリットルのRNAに沈め、さらに処理するまで最大3日間摂氏4度で保存します。

収穫するには、ガラスナイフを使用して無関係な組織を取り除き、スライスを個々のRNAに入れます。0.5ミリリットルの滅菌リン酸緩衝生理食塩水を含む1.5ミリリットルの遠心分離チューブをDNAフリーにします。細かい先端のペイントブラシスピンサンプルを使用して、10、000 RPMをステレオタイプな方法で1分間、すべてのスライスがチューブの同じ側に付着するようにします。

PBS上清を取り除き、サンプルを500マイクロリットルのトリオールに再懸濁します。サンプルをマイナス80°Cで保存するか、RNA抽出まで氷上に置いてください SI RNAノックダウンによるタンパク質発現の変化は、銀の強化とその後のデンシメトリック定量による従来のDAB免疫染色を強化することにより、高感度に評価できます。ここに示されているのは、記録マイクロ電極がCA 3パラメタルニューロン層に配置され、バイポーラ刺激電極が歯状回に配置されるスライス培養電気生理学的記録パラダイムです。

これは、歯状回刺激によって誘発されたCA3電界電位の例であり、これは半最大応答を確立するために使用され、ここでは、10ヘルツのバーストに対するCA3電界電位応答が、最終的にうつ病の広がりを引き起こす強度で徐々に増加したことを示しています。右下にあります。ここに示されているのは、模範的な生命免疫細胞です。

この画像は、ミクログリアの一部が、シナプス活動に反比例するレビーフライトとして知られる赤色で示された最適な探索パターンで長距離を移動することを初めて示しています。CDNAのPreem増幅により、海馬スライス培養物中のIFNガンマの検出が可能になります。当初、参照遺伝子RPL 13 AのCTは20.5で、左側ではIFNガンマは検出できませんでした。

しかし、右示のPreem増幅後、IFNガンマは29.0で容易に検出されました。RPL 13 A が 14.1 で登録され、シグナル増幅が 12 倍に増加したことを示すため、効率の免疫組織化学的確認がここに示されている。ペルオキシダーゼジアミンベンジン免疫染色の分化した銀強化は、siRNA処理された海馬スライス培養におけるシクロフィリンB産生の有意な減少を定量化するために使用されます。

このビデオで概説されている手法は、数日間にわたって実行できます。私たちの海馬スライス培養物は、in vivoの対応物に密接に近似しており、免疫シグナル伝達の研究やうつ病の広がりに理想的であることを強調したいと思います。しかし、静止免疫環境を制御下で偽の状態で維持することが不可欠です。

交絡免疫の活性化を最小限に抑えるために、培養物は無菌状態で維持する必要があります。過度の化学的、機械的、または熱的な摂動にさらされるべきではありません。生理学的サイトカインシグナル伝達はフェムトモルレベルで発生するため、高感度で再現性の高い測定技術を適用する必要があります。

PCRA技術と高感度プロテオミクス技術を使用しています。最後に、サイトカインは多面的であり、冗長です。だから。経時的に測定されたマルチプレックスサイトカインターゲットは、免疫シグナル伝達が捻挫、うつ病、ひいては片頭痛に対する感受性をどのように調節するかを研究するのに役立ちます。