Name: ハイスループットその場でハイブリダイゼーション法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶハイスループットその場でハイブリダイゼーション法を用いて、胎児マウスの下部尿生殖路組織におけるmRNA発現パターンの可視化手法です。カスタマイズしたバスケットを使用し、低豊度から高豊度の転写産物まで検出可能で、発生生物学研究に応用できます。

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著者らは、組織のバスケットの準備に技術支援のために博士が蘭李、ニュージャージー州のがん研究所を、感謝したいと思います。この作品は、健康補助金DK083425とDK070219の国民の協会によって資金を供給された。

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

方法ここで説明を使用して、それは間葉系パッド、尿路上皮、平滑筋、前立腺芽、射精管、および膣を含む胎児の雄と雌のマウスのLUTの主要な細胞型と組織区分のすべてのmRNAを検出することが可能である。このプロトコルで使用さ50μmのセクションでは、組織のアーキテクチャ（例えば、血管など）を解決するために十分な厚さという利点を持っていますが、一般的にホールマウントISH中に発生した方法論的問題であるプローブのトラッピングを、避けるために十分に薄いです。すべての新しいリボプローブは、染色前の発表された研究で評価されている陽性対照の組織、に評価される。我々は、染色パターンは、これらの組織に特異的であることを確認してください。提案手法のもう一つの利点は、複数のmRNAのパターンは同じLUTの組織から、隣接する組織切片で評価することができるということです。さらに、この方法は、細胞特異的タンパク質マーカーを視覚化し、ISHプロトコールで染色した細胞の種類を識別するために、免疫組織化学法と組み合わせて使用​​することができます。このメソッドは、ファストレッドまたはヘマトキシリン​​で核の対比染色として伝統的な対比の方法、互換性がありません。しかし、我々は、...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン抗体、Fabフラグメント</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BMパープルAP基質、沈澱</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP1600 - 100 </td></tr><tr><td>細胞培養用プレート、24ウェル</td><td>コー​​ニング</td><td> 3524 </td></tr><tr><td>ジゴキシゲニン11 - UTP </td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTPの</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td>両刃のカミソリの刃</td><td>ウィルキンソンソード</td><td>古典的なモデル</td></tr><tr><td> Eliminase RNaseの除去</td><td> Decon研究所</td><td> 1102 </td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td> F5786 - 1L </td></tr><tr><td>ゲル抽出キット</td><td>キアゲン</td><td> 28704 </td></tr><tr><td> H 2 Oにおけるグルタルアルデヒド、25％溶液</td><td>シグマ</td><td> G6257 - 100ML </td></tr><tr><td>ヘパリン、ナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> H3393 </td></tr><tr><td> H 2 O中の過酸化水素、30％溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP2633 - 500 </td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>シグマ</td><td> L9756 </td></tr><tr><td>ロックタイト404クイックセットの瞬間接着剤</td><td>ヘンケル（株） </td><td> 46551 </td></tr><tr><td>マグネシウムの塩化</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> M33 - 500 </td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>シグマ</td><td> M0375 - 500G </td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ、1.5mlの</td><td> Biologix調査会社</td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td> Millicell培養プレートインサート</td><td>ミリポア</td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td>分子研削樹脂</td><td> G -バイオサイエンス</td><td> 786 - 138PR </td></tr><tr><td>リン酸のパラホルムアルデヒド、4％溶液は、緩衝食塩水</td><td>アフィメトリクス</td><td> 19943 </td></tr><tr><td>リン酸塩は、Ca及びMgをすることなく、緩衝食塩水</td><td> MPのバイオメディカル</td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td>ポリエステルメッシュ、33ミクロン、12&quot;× 24&quot; </td><td>小さな部品株式会社</td><td> CMY - 0033 - D </td></tr><tr><td>プロテイナーゼKソリューション、20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195 - 5mlの</td></tr><tr><td> QIAshredderカラム</td><td>キアゲン</td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Qのソリューション</td><td>キアゲン</td><td> Taq DNAポリメラーゼに付属されています</td></tr><tr><td> RNaseの</td><td>シグマ</td><td> R6513 </td></tr><tr><td> RNase阻害剤</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasyミニキット</td><td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 RNaseフリーのDNase </td><td>プロメガ</td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque低融点アガロース</td><td>ロンザ</td><td> 50101 </td></tr><tr><td>ヒツジ血清</td><td>シグマ</td><td> S2263 - 500mLに</td></tr><tr><td> Stericupフィルタユニット、0.22μm、ポリエーテルスルホン、500ミリリットル</td><td>ミリポア</td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td>粒状のアジ化ナトリウム、 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S227I - 100 </td></tr><tr><td>ナトリウム塩化</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP358 - 212 </td></tr><tr><td>硫酸ドデシルナトリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S529 - 500 </td></tr><tr><td> SSC、20Xソリューション</td><td>研究プロダクツ国際</td><td> S24022 - 4000.0 </td></tr><tr><td>スーパースクリプトIII第一鎖合成システム</td><td>インビトロジェン</td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNAポリメラーゼ</td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNAポリメラーゼ</td><td>キアゲン</td><td> 201203 </td></tr><tr><td>トリス塩酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP153 - 1 </td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP337 - 100 </td></tr><tr><td>デラックスの試料槽と振動ミクロトーム</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td> VT1000A </td></tr><tr><td>酵母tRNA </td><td>ロシュダイアグノスティックス</td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmrnaの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

下部尿生殖路（LUT）の開発は複雑なプロセスです。この複雑さは、アンドロゲンシグナルと上皮-間葉相互作用の1,2に依存している胎児の男性の尿道から前立腺の形成の間に証明されています。前立腺の開発を担当する分子メカニズムを理解することは不適切にそのような良性前立腺肥大症や前立腺癌などの前立腺疾患を生じさせるために、その後の人生に呼び覚ますされている成長メカニズムを明らかにすることがあります。 開発LUTは、解剖学的に複雑です。出芽時の前立腺は16.5日後の構想（DPC）で始まることにより、多数の細胞タイプが存在する。血管系、神経や平滑筋は、間葉系間質3内に存在する。この基質は、多層上皮を囲み、アンドロゲン受容体依存性傍分泌シグナル4を介して胎児の前立腺を生じさせる。前立腺の開発とこれらの遺伝子に対応して前立腺管の上皮の形態は完全には理解されていないメカニズムのために必要な間質アンドロゲン受容体応答性遺伝子のアイデンティティ。正確に細胞の種類を識別し、それらの内の特定の因子の発現をローカライズする機能は、さらに前立腺の開発を理解することが不可欠です。in situハイブリダイゼーション （ISH）組織内のmRNAの局在化が可能になります。したがって、このメソッドは、それによって潜在的な前立腺の発達レギュレータの解明、シグナル分子とその受容体の発現のパターンとタイミングを識別するために使用することができます。 ここで、我々は、振動ミクロトームカットのセクションを使用して、胎児マウスのLUTでmRNAの発現パターンを識別するために、高スループットのISH法を説明します。このメソッドは、他のISHのプロトコルに比べていくつかの利点があります。スライドに付着した薄い切片上でISHを実行すると、技術的に困難であり、凍結切片やパラフィン切片の両方がしばしば弱い信号の解像度をもたらす間、凍結切片は、頻繁に悪い構造の品質を持っている。全体のマウント組織でISHを実行すると、プローブのトラッピングが発生する可能性があります。対照的に、私たちのハイスループット技術は、詳細な組織構造を明らかに分厚く切ったセクションを利用しています。修正されたマイクロチューブは、ISH手順の実行中にセクションを簡単に処理できます。 4 mRNAの転写産物の上限は、それによってコストと最大化効率を減少させる、一度の実行で検出された24のmRNA転写産物を最大で単一の17.5dpc LUTからスクリーニングすることができる。このメソッドは、それによってデータを解釈するための任意のバイアスを除去し、同じ単一のユニットとして処理される複数の治療群を可能にします。最も適切に前立腺の研究者のために、この方法では、前立腺管のネットワークを生じる胎児マウスの尿道が低く、高い多量のmRNA転写物の空間的、時間的な場所を提供します。

ここで、我々は、効率的な高スループットを記述<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（ISH）胎児マウスの前立腺組織切片を開発する際にmRNAの発現のパターンを可視化するための方法。方法は簡単に他のマウスの組織でまたは他の種から採取した組織中のmRNAの発現パターンを可視化するために適応させることができます。

ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmRNAの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

下部尿路（LUT）の発達は複雑なプロセスです。この複雑さは、胎児期の男性における前立腺の形成過程において顕著に現れます。

本手順の目的は、発達中のマウス胎児の下部尿生殖器組織におけるmRNA発現パターンを視覚化することです。これは、まずPCRで生成したテンプレートからジゴキシゲニン標識リボプローブを合成することで達成されます。手順の第2ステップでは、振動ミクロトームを用いて厚切りの切片を作成します。第3のステップは、特注のバスケットに入れた下部泌尿生殖管切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行うことです。リボプローブの結合を、BM purple沈殿性アルカリホスファターゼ基質を用いた免疫組織化学的検出により可視化します。最終的に、顕微鏡観察によって、胎生マウスの下部泌尿生殖管における低発現および高発現のmRNA転写産物の空間的および時間的な局在を示すことができます。免疫組織化学などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、リボプローブの作製が容易であり、マウスゲノム全体のほとんどのmRNAを認識するように作製できる点にあります。この方法は、マウス胎児の泌尿生殖器の発達過程におけるmRNA発現パターンの知見を提供しますが、他の器官系、種、および発達段階にも適用可能です。組織をアガーに埋め込む操作は習得が困難な場合があり、また、向きのわずかな違いが結果の不整合につながる可能性があるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。組織を準備する少なくとも1日前に、直径12mmのミリセル培養プレートから膜を取り除いて廃棄します。残ったリングは型として機能するため、RNase阻害剤溶液に一晩浸漬させておきます。プロトコル実施日に、段階的なメタノール置換で再水和させたマウスの下部泌尿生殖器を解剖します。PBS tweenで洗浄し、膀胱の約3分の2を廃棄して、残りの下部泌尿生殖器組織をPBS tweenに保存します。次に、処理済みのリングモールドをガラス顕微鏡スライドの上に置き、62 °Cに加熱した4%低融点アガロース溶液を満たし、約2分間冷却します。次に、下部泌尿生殖管組織をブロット乾式し、アガロース溶液に浸します。ピンセットを使用して組織を向き調整し、リングの上下の中間に吊るされた状態にします。アガロースが凝固するまで、4 °Cでインキュベートします。組織をスライスする前に、溶剤で洗浄し、続いて水で洗浄して、カスタマイズしたウィルキンソン刃を準備します。ダブルブレードを縦に2つのシングルブレードに分離します。次に、マイクロトーム刃でウィルキンソン刃を固定します。まず、マイクロトーム刃をウィルキンソン刃と同じ長さに切断します。次に、Lock Tite接着剤を用いて、切断端から約3～4 mmオフセットさせた位置でマイクロトーム刃をウィルキンソン刃に接着します。これで補強された刃を振動マイクロトームに取り付け、刃の角度を35度に設定します。バスにPBSを満たし、周囲を濡れた氷で

a-high-throughput-situ-hybridization-method-to-characterize-mrna

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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