ハイスループットその場でハイブリダイゼーション法

本手順の目的は、発達中のマウス胎児の下部尿生殖器組織におけるmRNA発現パターンを視覚化することです。これは、まずPCRで生成したテンプレートからジゴキシゲニン標識リボプローブを合成することで達成されます。手順の第2ステップでは、振動ミクロトームを用いて厚切りの切片を作成します。

第3のステップは、特注のバスケットに入れた下部泌尿生殖管切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行うことです。リボプローブの結合を、BM purple沈殿性アルカリホスファターゼ基質を用いた免疫組織化学的検出により可視化します。最終的に、顕微鏡観察によって、胎生マウスの下部泌尿生殖管における低発現および高発現のmRNA転写産物の空間的および時間的な局在を示すことができます。

免疫組織化学などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、リボプローブの作製が容易であり、マウスゲノム全体のほとんどのmRNAを認識するように作製できる点にあります。この方法は、マウス胎児の泌尿生殖器の発達過程におけるmRNA発現パターンの知見を提供しますが、他の器官系、種、および発達段階にも適用可能です。組織をアガーに埋め込む操作は習得が困難な場合があり、また、向きのわずかな違いが結果の不整合につながる可能性があるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。組織を準備する少なくとも1日前に、直径12mmのミリセル培養プレートから膜を取り除いて廃棄します。残ったリングは型として機能するため、RNase阻害剤溶液に一晩浸漬させておきます。

プロトコル実施日に、段階的なメタノール置換で再水和させたマウスの下部泌尿生殖器を解剖します。PBS tweenで洗浄し、膀胱の約3分の2を廃棄して、残りの下部泌尿生殖器組織をPBS tweenに保存します。次に、処理済みのリングモールドをガラス顕微鏡スライドの上に置き、62 °Cに加熱した4%低融点アガロース溶液を満たし、約2分間冷却します。

次に、下部泌尿生殖管組織をブロット乾式し、アガロース溶液に浸します。ピンセットを使用して組織を向き調整し、リングの上下の中間に吊るされた状態にします。アガロースが凝固するまで、4 °Cでインキュベートします。

組織をスライスする前に、溶剤で洗浄し、続いて水で洗浄して、カスタマイズしたウィルキンソン刃を準備します。ダブルブレードを縦に2つのシングルブレードに分離します。次に、マイクロトーム刃でウィルキンソン刃を固定します。

まず、マイクロトーム刃をウィルキンソン刃と同じ長さに切断します。次に、Lock Tite接着剤を用いて、切断端から約3～4 mmオフセットさせた位置でマイクロトーム刃をウィルキンソン刃に接着します。これで補強された刃を振動マイクロトームに取り付け、刃の角度を35度に設定します。

バスにPBSを満たし、周囲を濡れた氷で囲んでデラックス標本バスを準備します。プラグに埋め込んだ組織をマウントする前に、リングモールドから取り出し、底面をブロック乾燥させます。次に、乾燥させた面をLoctite接着剤を用いてマウントディスクに接着します。

ディスクを振動切片機に装着し、切片の厚さを50 micronsに、速度を2に、ブレードの振幅を4に調整します。組織切片を切り出しながら、鈍端ピンセットを用いて各切片を、0.5 mLの氷冷PBS tweenを満たした24ウェル培養プレートに移します。スライス後、in situ ハイブリダイゼーションを開始する前に、スプリングシザースを用いて各組織切片の周囲からアガロースの大部分を取り除きます。切片は、2 mMのアジ化ナトリウムを含むPBS tween中で、4 °Cで最大48時間まで保存可能です。

まず、マイクロ遠心チューブの100 µLの印で底を切り取り、カスタムサンプルバスケットを作成します。チューブの切り取り部分を炎で加熱し、プラスチックが柔らかくなるまで温めます。次に、柔らかくなったプラスチックをメッシュ正方形の上にしっかりと押し付けます。

硬化させ、余分なメッシュを切り落とします。加熱した18ゲージの針を使用して、各チューブの蓋に2つの穴を開け、バスケットを完成させます。24ウェルプレートの蓋に、等間隔に12 millimeterの穴を24個開けることで、サンプルバスケットを保持するトレイを作成します。

各穴がウェルの真上に位置していることを確認した後、約1.3 cmの水道水を満たし、蓋をしたハイブリダイゼーションチャンバーを60.5 °Cに予熱し始めます。24ウェル培養プレートの各ウェルに2 mLのPBS tweenを加えて、in situ ハイブリダイゼーションを開始します。バスケットを装着した準備済みの蓋でこのプレートを覆います。

次に、組織切片を室温でバスケットに移し、6%過酸化水素含有PBS tweenでロッキングインキュベートします。続いて、PBS tweenによる一連の洗浄、プロティーナーゼKによるインキュベーション、再度固定、およびさらなる洗浄を行います。サンプルの調製を完了させるため、各ウェルに2 mLのプレハイブリダイゼーション緩衝液を加え、プレートを加熱ハイブリダイゼーションチャンバー内で少なくとも1時間インキュベートします。各ウェルに0.5 µgの標識RIBA Probeを添加し、ハイブリダイゼーションを開始します。

その後、加熱ハイブリダイゼーションチャンバー内で一晩インキュベーションを継続します。翌日、組織を溶液1で洗浄し、徐々に溶液2へと切り替えて洗浄した後、RNAで処理します。次に溶液3で洗浄し、続いてTBS Tweenおよび組織ブロッキングバッファーで洗浄し、組織を組織ブロッキングバッファー中でインキュベートします。

インキュベーション期間後、抗dig抗体を抗体吸収バッファー中で4°Cで最低2時間インキュベートします。抗体溶液を10,000 RPMで1分間遠心分離します。不溶物を除去するため、抗体溶液バッファー2 mLにSennaを加えます。

次に、組織をブロッキングバッファーから取り出し、調製した抗体溶液中でインキュベートします。手順の3日目には、ハイブリダイゼーションチャンバーに入れ、4 °Cで一晩保持します。その後、組織をTBSTで数回洗浄します。

次に、ガラス製パステールピペットを用いて、組織を清潔なマイクロ遠心チューブに慎重に移します。1 mLのNTM溶液で組織を10分間洗浄します。

次に、溶液をlava sole MBM purpleを含むTMTに置換します。チューブを暗所に置き、その後数日間にわたって色の発現を観察し、必要に応じて溶液を交換してください。完全に発色した後、組織をlava soleを含むTMTで短時間洗浄し、その後、パラホルムアルデヒドを含むPBS中で4°Cにて一晩インキュベートします。

翌日に組織の漂白および洗浄を行います。これで切片のイメージング準備が整いました。下部尿路組織は、尿道の正中線がアロスプラグの平面と平行になるようにアガロースに包埋されました。

この方向で切断することで、正中断面が得られました。特製のサンプルバスケットを用いることで、繊細な組織切片を埃や粒子状物質から保護しました。これは数日間にわたるC2ハイブリダイゼーションの手順中に行われました。

また、これにより切片の脱落を防ぎました。低発現のmRNAを検出するために必要な長時間のインキュベーションにおいて、バックグラウンド染色の抑制は困難な課題です。しかし、アジ化ナトリウムの添加とそれに続くろ過によって、バックグラウンド染色の抑制が可能になったと考えられます。

さらに、サンプルを呈色溶液で長時間インキュベートしても、バックグラウンド染色の可視的な差は見られませんでした。この手法に習熟すれば、適切に実施することで6日間で完了させることができます。本手順の後、免疫組織化学などの他の手法を用いて、mRNAの発現パターンがタンパク質の発現パターンと相関しているかを確認することが可能です。

このビデオを視聴することで、マウスの下生殖器管の発達におけるmRNAの発現パターンの可視化方法について、十分に理解することができます。