アンインビトロシステム

本実験の全体的な目的は、腫瘍の休眠状態または転移性増殖への移行をモデル化する以下のin vitroアッセイを用いて、潜在的な薬剤が腫瘍細胞の休眠および／または休眠からの脱却に及ぼす影響を、リアルタイムかつハイスループットに観察することです。これはまず、96ウェルプレートプラットフォームに適応させた3次元培養基底膜抽出物（BME）システムにおいて、休眠状態および／または転移性の腫瘍細胞を培養することで達成されます。この3Dシステムで培養されると、転移性細胞は一過性の休眠状態または静止期に入ります。

対照的に、in vivoで休眠状態にある腫瘍細胞は、長期的な静止期に入ります。3D培養システムを用いることで、転移細胞を候補薬剤で処理し、静止期から増殖期への移行を抑制することが可能になります。一方で、休眠腫瘍細胞に対しては、静止期から増殖期への移行を誘導しうる候補薬剤を用いて治療を行うことができます。

治療の結果としての休眠細胞および転移細胞の増殖挙動は、目的の時間点においてCellTiter-96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kitを添加し、ELISAプレートリーダーで分析することでスコア化します。これにより、3Dシステムにおける細胞増殖アッセイに基づいた、休眠腫瘍細胞または転移腫瘍細胞の細胞増殖に対する治療の効果を示す結果が得られます。この手法は、どのような因子や細胞メカニズムが播種腫瘍細胞を休眠状態で維持しているのか、また、どのような因子や細胞メカニズムが腫瘍の休眠から臨床的な転移への移行を誘導するのかといった、転移研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。

増殖アッセイを実施する前日の夜、成長因子除去BMEを4 °Cの冷蔵庫で一晩静置します。その後、アッセイ当日、休眠状態または転移性の腫瘍細胞培養物のいずれかを実験に選択します。次に、96ウェルプレートをラミナーフローフード内の氷上に置いたトレーの上に配置します。

次に、シリンジ付きディスペンサーを使用して、プレートの各ウェルに解凍し氷冷したBMEを50 µLずつコーティングします。ウェル内に気泡が形成されていないことを確認し、BMEをコーティングした96ウェルプレートを、5% carbon dioxide、37 °Cの加湿インキュベーターで30分間インキュベートします。BMEコーティングプレートのインキュベーション中に、トリプシンのボトルを37 °Cに置いて温めておきます。

腫瘍細胞から培地を吸引します。培養プレートを10 millilitersのPBSで洗浄します。その後、PBSを吸引し、予め温めておいたtrypsin 2 millilitersを培養プレートに加えます。

プレートを5分間インキュベートします。15 mLのコニカルチューブに、10% FCSおよび抗生物質を添加したDMEM high glucoseを5 mL加えます。この間に。

インキュベーション後、剥離した細胞を15 milliliterチューブに移し、細胞数をカウントします。次に、培養する全細胞数を組織培養用遠心機を用い、室温で1500 Gで5分間遠心分離します。上清を慎重に吸引します。

多くの場合、ペレットは目視できないため、培地を少量残しておきます。次に、チューブの底を軽く叩き、単一細胞懸濁液になるようにします。その後、細胞2 × 10³個につき100 µLのアッセイ培地を用いてペレットを再懸濁します。

5 mL ピペットを用いて細胞を繰り返しトリチュレーションし、単一細胞懸濁液が維持されるようにします。コントロール用の96ウェルBMEコートプレートの各ウェルに、細胞懸濁液を100 µLずつ播種します。バックグラウンド減算用として、96ウェルBMEコートプレートの数ウェルのみに、アッセイ培地をさらに100 µLずつ加えます。その後、プレートをインキュベートし、4日ごとに古い培地を吸引除去して新しいアッセイ培地を補充します。

細胞増殖を評価するため、所定の実験時間において、解析対象の各96ウェルプレートのウェルに、細胞増殖アッセイキットに含まれるCell Titer 96 Aqueous One溶液を20 µLずつ添加します。プレートを2時間インキュベートします。その後、ELISAプレートリーダーを用いて、免疫蛍光染色の準備として、実験ウェルとバックグラウンドウェルの両方の吸光度を490 nmで測定します。

細胞シグナル伝達分子および腫瘍細胞の染色。染色の前日に、BMEを4°Cの冷蔵庫で一晩解凍します。染色の当日、8チャンバーガラススライドシステムを、ラミナーフローフード内の氷上のトレイに配置します。次に、200 µLピペットを使用して、ガラススライドシステムの各ウェルに氷冷BMEを50 µLずつコーティングします。

BMEが均一に広がり、ウェル内に気泡が形成されていないことを確認します。コートしたスライドを20分間インキュベートします。休眠状態または転移性の腫瘍細胞株のいずれかを選択します。

前述の手順に従い、トリプシンを用いて細胞を回収します。次に、培養する全細胞数を15 mLコニカルチューブにまとめます。細胞を遠心分離し、少量の培地を残して上清を慎重に吸引します。

ペレットを得るため、15 mLコニカルチューブの底を軽く叩き、単一細胞懸濁液にします。細胞5×10³個につき400 µLのアッセイ培地を用いてペレットを再懸濁させます。単一細胞懸濁液の状態を維持するため、5 mLピペットで細胞を数回トリチュレーション（ピペッティング）します。BMEコーティングされた8つのチャンバーの各ウェルに、細胞溶液を400 µLずつ分注します。

その後、ガラススライドシステムをインキュベートし、古い培地を吸引して、目的の実験タイムポイントに合わせて4日ごとに新しいアッセイ培地を細胞に供給します。培地上層を吸引し、Tritonを添加した固定液200 µLを加え、室温で5分間インキュベートします。次に、Triton添加固定液を吸引し、固定液のみを200 µL加えて、さらに25分間室温でインキュベートします。

固定液を再度吸引し、各ウェルにPBSを400 µLずつ加えます。プレートを室温でさらに10分間インキュベートします。その後、PBSを吸引し、0.05% Tween 20を含むPBSを400 µL加え、さらに10分間インキュベートします。

同様に室温で置いてください。次に、固定した細胞を200 µLのブロッキング液でブロッキングします。その後、細胞を室温で1時間インキュベートし、インキュベーション後にブロッキング液を吸引除去し、ブロッキング液で希釈した一次抗体200 µLをそれぞれに加えます。

スライドを一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートし、翌日に操作を行います。抗体を吸引除去した後、400 µLのPBSを加えて15分間洗浄し、その後溶液を吸引する操作を3回繰り返します。最後の洗浄でPBSを吸引除去した後、RFP（Rhodamine Red）標識二次抗体を200 µL加えます。

その後、8チャンバースライドシステムをアルミホイルで覆い、室温で1時間インキュベートします。次に、前述と同様にウェルをPBSで3回洗浄し、3回目の洗浄後、dpiを含むbeta shield封入剤でスライドを封入します。

最後に、スライドを室温の暗所で40分間乾燥させます。3D培養における休眠状態のD 2.0 R細胞および転移性のD two A one腫瘍細胞の増殖解析の例をここに示します。D 2.0 R細胞は14日間の全実験培養期間を通じて休眠状態にありますが、転移性の高いD two A one細胞は培養開始から4〜6日間のみ休眠状態にあり、その後、初期休眠相の間に増殖を開始します。

ここに示す4日目の培養の代表的な写真のように、多くの細胞は3D培養内で単独のままですが、増殖しない他の細胞は多細胞のスフェロイドを形成します。3D培養におけるD2A1細胞の休止状態から増殖状態への移行が、この12日目の培養写真に示されています。この図において、それは細胞形態の劇的な変化を伴っています。

D2A1細胞が休止状態から増殖状態へ移行するのを阻止する薬剤の例として、特異的なミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤を用いたD2A1細胞の処理が示されています。本図に示されているように、D2A1細胞を休止状態で維持します。休止期（1〜4日目）から増殖期への移行に伴い、赤色で示されるD2A1細胞におけるミオシン軽鎖のリン酸化が著しく増加し、続いて緑色で示されるFアクチンフィラメントの再編成によるアクチンストレスファイバーの形成が起こります。

7日目です。しかし、SHRAまたは薬剤ML-7を用いてD2A1細胞のミオシン軽鎖キナーゼ活性を阻害すると、D2A1細胞は休眠状態で維持され、ここで見られるように、ミオシン軽鎖のリン酸化、F-act、およびストレスファイバーの構築が抑制されます。このビデオを視聴することで、腫瘍の休眠および転移性増殖への移行を研究するためのin vitroモデルシステムの構築方法について、十分に理解できたはずです。