三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

この手順の総合的な目的は、メラノサイト、メラノーマ、および皮膚幹細胞生物学の研究のために、ヒト皮膚の3D再構成モデルを作製することです。これは、まず組織培養トレイのインサートを中和したウシコラーゲンでコーティングすることによって達成されます。次のステップでは、線維芽細胞とコラーゲンを用いて細胞性真皮層を作製します。

次に、ケラチノサイトにメラノサイトまたはメラノーマ細胞を混合し、表皮コンパートメントを作製します。本手順の最終ステップは、18日目に皮膚再構築物を回収し、それをマウスに移植することです。最終的に、移植片の免疫組織化学的および免疫蛍光分析により、メラノサイトを含む正常皮膚の構造、正常幹細胞の遊走と分化、およびステージ特異的なメラノーマの表現型が示されます。

私たちは20年前に皮膚再構築モデルを開発しました。というのも、研究の初期段階で、ディッシュ上で培養された通常のメラノサイトやメラノーマ細胞は、組織コンテキスト内に存在する細胞とは非常に異なる挙動を示すことが分かったためです。したがって、皮膚再構築モデルは、細胞が皮膚の一つのコンパートメントから他の場所へどのように移動するかを観察するのに理想的です。あらかじめ調製した無細胞層コラーゲン混合物を氷上で準備し、6ウェルプレートの各インサートに淡黄色の溶液を1 mLずつ加えます。

ウェル付き組織培養プレートを室温で30分間インキュベートし、ゲルを凝固させます。この間に、ゲルが凝固するにつれて溶液の色が黄色からピンク色に変化します。0.25% trypsin EDTAを用いて、培養フラスコからヒト線維芽細胞をトリプシン処理し、5分後に回収します。10% FBSを含むDMEMを添加し、トリプシン化反応を停止させます。

室温で200 Gで5分間遠心分離し、剥離した細胞を回収します。その後、10% FBSを添加したDMEMを用い、1.5 mLあたり4.5×10⁵ cellsの濃度で細胞を再懸濁します。次に、あらかじめ調製しておいた細胞層コラーゲン混合液を50 mLチューブに満たし、チューブを氷上に置きます。

線維芽細胞懸濁液を1.5 millilitersチューブに加え、十分に混合する。わら色の細胞層溶液を3 millilitersずつ、細胞外マトリックス層でコートした各インサートに加える。その後、組織培養トレイを5% carbon dioxide組織培養インキュベーター内で37 degrees Celsiusで45分間インキュベートする。

細胞層溶液の色も、黄色からピンク色に変化するはずです。上層のゲルが凝固した後、組織培養トレイ内のインサート内部に10%FBSを含むDMEMを2 mL、インサート外部に10 mL添加します。組織培養トレイを4日間インキュベートします。

培養4日目にゲルの収縮を確認し、各インサートの内側と外側から培地を吸引します。インサートの内側に2 mL、外側に10 mLの洗浄用培地を加え、通常血清を洗い流します。その後、表皮を形成させるため、トレイを37 °Cで1時間インキュベートします。

まず、ヒト角化細胞をトリプシン処理します。その後5分後、分離した細胞を 200 G で5分間遠心分離し、大豆トリプシンインヒビターを用いてトリプシンを中和します。その後、細胞ペレットを再懸濁し、皮膚内で 4.17 × 10⁶ cells/mL の濃度に調整します。

ケラチノサイトを回収した後、培地1を再構成します。ヒトメラノサイトをトリプシンで1〜2分間処理します。その後、大豆トリプシンインヒビターを用いて再びトリプシンを中和します。

その後、前と同じ条件で細胞を遠心分離し、メラノサイトペレットを皮膚用再構築培地1を用いて 8.3 × 10⁵ cells/mL の濃度で再懸濁します。再構築培地1も同様に調製してください。次に、作製した真皮層組織培養トレイの各インサートの内側および外側から洗浄培地を除去します。

各インサートの内側に1.5 mL、外側に10 mLの皮膚再構築培地を加え、洗浄液と交換します。次に、600 µLのケラチノサイト細胞懸濁液と600 µLのメラノサイト懸濁液を混合します。この混合細胞懸濁液を200 µLずつ分注します。

各インサートの内側に1滴ずつ滴下します。組織培養トレイを37°Cで2日間インキュベートします。細胞のインキュベート後、各インサートの内側と外側の両方から皮膚再構築培地1を吸引し、次に皮膚再構築培地2をインサートの内側に2 mL、外側に10 mL加えます。

その後、再構築物を37 °Cでさらに2日間インキュベートします。2回目の2日間のインキュベーション後、各インサートの内側と外側からskin reconstruct medium twoを吸引します。次に、インサートの外側にのみ7.5 mLのskin reconstruct medium threeを加えます。

再構成体をインキュベーターに戻し、培地を交換します。18日目まで、2日おきに再構成体用培地3に交換してください。培養18日目に、皮膚再構成体が配置された組織培養トレイのインサート内部および外部から培地を吸引します。

ピンセットを使用して、トレイからインサートを取り出します。メスを用いて、ポリカーボネートフィルターを含む構築物の縁に沿って円を描くように切り出します。次に、フィルター上の構築物を硬い平面に置き、メスで半分に切断します。

再構築物の半分を黒色のTBS生検用紙に載せ、その用紙を組織カセットに入れます。カセット全体を10% formalinに4時間以上浸します。その後、カセットを70% ethanolに入れ、再構築物をパラフィン包埋処理するまで4 °Cで保存します。

再構築したサンプルの残りの半分を、4°Cで1〜2時間、50% sucroseに浸します。その後、sucroseを2 Mに変更し、さらに4°Cで1〜2時間保存します。ベースモールドの半分まで、最適切断温度包埋剤（OCT）を満たします。

気泡が入らないように注意してください。ピンセットで再構成体の端を掴み、ショ糖溶液から取り出します。ショ糖が吸収されるまで、キムワイプの上に置いてください。

ピンセットとスパチュラを用いて、再構築組織をOCT上のボートに転送します。ボートがいっぱいになるまで、再構築組織の上からさらにOCTで覆います。この際、同様に気泡が入らないように注意してください。

OCTを完全に凍結させるため、ボートを砕いたドライアイスの上に均等に配置します。その後、ベースモールドとホイルで包み、クライオスタットで切断するまで-70 °Cで保存します。マウスへの皮膚再構成物の移植準備として、容器に液体窒素を満たし、50 mLチューブに5 mLのDMEMを加えます。

ビーカーに水道水 600 milliliters を満たし、ホットプレートの上に置いて温めます。次に、生後約6週齢の雌のskidヘアレスアウトブレッドマウスを選択します。マウスをイソフルランで麻酔させた後、

処置の間、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します。無菌の眼用潤滑剤を塗布し、低体温症を防ぐために保温処置を行います。次に、コンパウンドベンゾインチンクチャーとアルコール綿でマウスの皮膚を清浄します。

後で縫合する際に同じ位置を維持できるよう、マウスの背中の上部に線をマークします。アイリス剪刀とピンセットを用いてマウスの背中に円形の創傷部位を作成し、その後、創傷部位を滅菌ガーゼスポンジで覆います。切り出した円形のマウス皮膚をDMEMが入った50 milliliterチューブに入れます。

チューブを液体窒素容器に浸し、培地と組織が完全に凍結するまで待ちます。次に、チューブを温水のビーカーに入れ、完全に融解するまで解凍します。この凍結・融解の手順を3回繰り返します。

外科用メスを使用して、インサートから皮膚再構築物を剥離させます。膜を非常に慎重に取り除き、皮膚再構築物をマウスの創傷床の上に転移させます。次に、マウスの皮膚を皮膚再構築物の上に被せます。

最初の縫合糸が先にラベル付けしたマーカーの上に、2番目の縫合糸が下に位置するようにしてください。次に、皮膚再建部位の両側にさらに2本の縫合糸を用いて、マウスの皮膚を固定します。移植後にマウスの皮膚を洗浄し、マウスを新しいケージに移します。

18日目。皮膚再構築物の表皮は層状のケラチノサイト層で構成されており、未分化な基底層と、それに続く分化層が垂直方向に並んでいます。再構築物の切片をメラノサイトマーカーで染色します。

黒い矢印で示されたS 100により、メラノサイトが表皮の基底層に配列し、樹状突起を介して複数のケラチノサイトと相互作用していることがわかります。真皮層には、沈着したコラーゲンI型マトリックスに埋め込まれた線維芽細胞が含まれています。コラーゲンIVは、表皮と真皮を隔てる基底膜を示しています。以下の図では、表皮においてケラチノサイトがどのように多層化して発達するかを説明します。

GFPレンチウイルスベクターで標識した真皮幹細胞を線維芽細胞と共に埋め込んだ場合、コラーゲンI型マトリックス中でそれらは表皮へと遊走し、5日目にメラノサイトへと分化します。角化細胞を播種すると、単一細胞がスフィアから遊走し始めます。

表皮は依然として単層で構成されていることに注意してください。8日目になると、少数の細胞が表皮と真皮の界面に到達します。

10日目までには、ここで見られるように、GFP陽性細胞が基底膜の位置に密に並びます。表皮内に遊走したGFP陽性細胞は、メラノサイトマーカーであるHMB 45を発現します。皮膚再構築モデルに異なる段階のメラノーマ細胞株を組み込むと、細胞の挙動はそのin vivoでの特性を反映します。

この図では、2D培養で増殖させた正常メラノサイトとメラノーマ細胞が確認できます。ここに見られるように、皮膚再構築物における正常メラノサイトの位置と増殖速度は厳密に制御されています。また、放射状増殖期の原発性メラノーマは主に表皮内で増殖しますが、垂直増殖期のメラノーマはこの図に示すように真皮へと浸潤性に増殖します。最後に、転移性メラノーマが真皮深層へと侵襲的に浸潤する様子がここで確認できます。

正常皮膚における我々の研究は、メラノーマの発生と進行に関する知見を深めるための基盤となります。