Name: 三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶ三次元ヒト皮膚再構築モデルを用いたメラノサイト生理とメラノーマ進行の研究法。線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイトを用いた皮膚構築により、創薬前臨床評価に有用なツールを提供します。

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我々は、ウィスター研究所の動物施設、顕微鏡施設、Histotechnology施設と研究のサプライセンターに感謝します。この調査は健康CA 076674、CA 098101、CA 025874と、CA 10815の国立研究所からの補助金によって一部で賄われていた。

1。三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築： <ol><li>無細胞層の調製：0.59 mLの10X EMEM、50μlの200mmのL -グルタミン、0.6 mLのFBS、120μlの7.5％の重炭酸ナトリウムおよび4.6 mLのウシコラーゲンIの1 mLを追加：氷上で50 mLのチューブに以下の試薬を混合組織培養トレーの各インサートに混合。室温で30分間インキュベートし、ゲルが固化することができます。混合物の色は淡黄色からピンクにしてください。 </li><li> DMEMを中和するために10％FBSを含む追加、0.25％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒト線維芽細胞をトリプシン処理。 10％FBSを1.5 mLのDMEMで遠心分離し、再懸0.45 × 10 6個の細胞で細胞を回収。皮膚幹細胞の場合は、遠心分離、球を分離するためにフラスコをタップすることで、6600皮膚の球を（皮膚の幹細胞は幹細胞の培地で生育したとき、彼らはニューロスフェアと同様の方法で球を形成する）を収集。 </li><li>細胞層の調製：氷の上を50mLチューブに次のようにミックス：1.65 mLの10X EMEM、150μlの200mMのL -グルタミン、1.85 mLのFBS、350μlの7.5％の重炭酸ナトリウム、14mlのウシコラーゲンIおよび1.5 mLの線維芽細胞の懸濁液ステップ2（代 ​​わりに、皮膚幹細胞再構築のために私培地を再構成皮膚の1.5mLの、0.45 × 10 6線維芽細胞および6600真皮球の組み合わせを使用する）から、よく混ぜる。それぞれの無細胞層でコーティングされたインサートの混合液を3 mLを加え。 37℃で5％CO 2組織培養インキュベーターで45分間インキュベートする。混合物の色はピンクに黄色の麦わらからする必要があります。ゲルが固化した後、DMEM 10％FBSを（2mLの内側と皮膚の再構築トレイの各ウェルに挿入10mLの外）を含む追加。 4日間インキュベートし、ゲルの契約のことを確認してください。 </li><li>各インサートの内側と外側の両方から培地を吸引除去する。定期的に血清を洗い落とすために、内側とインサートの外側に10mLに培地（1％透析FBSとHBSS）を2mLの洗浄に追加します。 37℃で1時間インキュベート℃に</li><li>皮膚の準備は、メディアを再構築： <ol><li>正常メラノサイトと皮膚幹細胞のために再構築：基本培地（500 mL）を作成するには、以下の試薬を混合：490 mLのケラチノサイト無血清培地、1.8 mLのウシ下垂体抽出物、10 mLの透析ウシ胎児血清、10μgの/ 500μLをmLのSCF、4μg/ mLのbFGFおよび264μg/ mLのET - 3の500μlの562.5μL。培地I：100mLの基本培地に100μg/ mlの10μlのEGFを追加する。培地II：100mLの基本培地に2μlのEGFを追加する。培地III：300mlの基本培地に1 Mの720μlのCaCl 2を追加。 </li><li>黒色腫の皮膚のために再構築：中I（100mLの）は、以下の試薬を混ぜるようにするには：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、200の200μlのヒドロコルチゾン500XμlのITES、200μlの0.05のO - phosphorylethanolamine M、90 mMの、2 nmの200μlのプロゲステロン、1 M 240μLのCaCl 2、10 nMの200μlのトリヨードチロニンとchelexed新生児ウシ血清100μlを200μlのアデニン（、血清100mLにChelex 100の3gを溶解し4℃で1.5時間℃で、フィルター滅菌をかき混ぜる）。ミディアムII（100mLの）を作るために、以下の試薬を混ぜる：DMEMの72.5 mLの、F12の24 mLの（HAMのを）、2 mLの200 mMのL -グルタミン、269 g / mlで、500Xの200μlのITES200μlのヒドロコルチゾン、 1 M、10 nMの200μlのトリヨードチロニンと100μlの新生児ウシ血清の200μlの0.05のO - phosphorylethanolamine M、90 mMの200μlのアデニン、2 nmの200μlのプロゲステロン、240μlの塩化カルシウム。ミディアムIII（300ML）を作るために、以下の試薬を混合：DMEMの142.5 mLの、F12の142.5 mLの（HAMの）、200mMのL -グルタミンの6 mLを、269 g / mlで、500Xの600μlのITESの600μlのヒドロコルチゾン、0.05の600μlのO - phosphorylethanolamine M、90 mMの600μlのアデニン、2 nmの600μlのプロゲステロン、1の720μLのCaCl 2、M、10nmと6 mLの新生児ウシ血清の600μlのトリヨードチロニン。 </li></ol></li><li>大豆トリプシンインヒビター（1Xリン酸塩の250 mg / Lの緩衝生理食塩水）でトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトケラチノサイトをトリプシン処理、培地を再構成皮膚の4.17 × 10 6細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウンI. </li><li>培地I.を再建皮膚0.83 × 10 6細胞/ mLで細胞ペレットを再懸濁し、スピンダウン、大豆トリプシンインヒビターとトリプシンを中和し、0.05％トリプシン/ EDTAで培養フラスコからヒトメラニン細胞または黒色腫細胞をトリプシン処理</li><li>各インサートの内側と外側の両方から培地を洗濯取り外します。 </li><li>皮膚が培地I（各インサートの外側に内側と10 mLの1.5 mL）を再追加。 </li><li> 、ケラチノサイトとメラノサイトまたはメラノーマ細胞の600μlの細胞懸濁液の600μlの細胞懸濁液を取るよく混ぜる。各インサートの内側にドロップして200μlの混合細胞懸濁液のドロップを分注する。皮膚幹細胞の場合は、再構成するケラチノサイト懸濁液100μlをのみ使用します。 37℃で2日間インキュベート℃に</li><li>私培地を再構築皮膚を吸引除去する内側と各インサートの外側の両方から。培地IIに（内側から2 mLおよび外側に10 mL）を再構成皮膚を追加。 37℃でさらに2日間インキュベート℃に</li><li>吸引皮膚は内側から培地IIを再構成し、各インサートの外側には、7.5mlのスキンは外側だけに培地IIIを再追加。この点から、表面が空気にさらされている開始再構成する。 18日目まで一日おきに培地IIIを変更します。 </li><li>収穫の皮膚は、一日18で再構築： <ol><li>内側とインサートの外側から培地を吸引除去する。 </li><li>ピンセットでトレイからインサートを取り外します。 </li><li>手術用メスの刃で端に円形の近くにトレースすることで（ポリカーボネートフィルターを含む）の再構築を切り取ります。 </li><li>ハード面で再構築し、半分にフィルターをカット。 </li></ol></li><li>パラフィン切片の場合：2黒TBS生検の論文との間の組織学のカセットに再構築し、4時間以上10％ホルマリンで全体のカセットを浸漬の半分を置きます。その後70％エタノールでカセットを配置し、それを4℃で保存して、パラフィン包埋のために再処理するための準備が整うまで。 </li><li>凍結切片の場合： <ol><li>の他の半分を置きます4で50％のショ糖で再構築° Cを1〜2時間、その後2Mにショ糖を変更し、別の1〜2時間4℃に保存。 </li><li>それは船の約50％を埋めるように使い捨てのベース金型に最適な加工温度の凍結媒体（OCT）を分注する。 OCTのいずれかの泡を避けてください。 </li><li>鉗子で再構築し、スクロースから再構築削除のエッジをつかむ。キムワイプはショ糖を吸収するまでキムワイプの上に置きます。 </li><li>鉗子やヘラを使用して、OCTの上にベースの金型に再構築を移す。ベースの金型が完全にいっぱいになるまで多くのOCTで再構築の上部をカバーしています。あなたが困難にカットできるようになりますOCTでいかなる気泡がないことを確認してください。 </li><li>砕いたドライアイス上で均等に基本型を置き、そして、OCTは完全に凍結することができます。 </li><li>スズ箔で基本型をラップし、それを-70℃で保存するクライオスタットでそれを切る準備が整うまで。 </li></ol></li><li>移植皮膚は、マウスで再構築： <ol><li> DMEMの5mLの（凍結と解凍のマウスの皮膚用）と50 mLのファルコンチューブを準備します。 </li><li> 6週間前後雌SCIDへアレス非近交系マウスを使用してください。 </li><li>マウスは、イソフルランで麻酔です（EZ麻酔システム）：最初の麻酔は、イソフルラン4％（マウスが手術台に移動される前）で誘導チャンバ内で行われ、手続き時にノーズコーンブリーザーによって麻酔を維持している（イソフルラン：1.5〜2パーセント）。低体温麻酔時の眼の怪我を防ぐために適用される無菌眼科用潤滑油を防止するために、加熱パッドにより熱のサポート。 </li><li>ビーカーに600mlの水を入れ、40との間に水の温度を保つためにホットプレートの上に残す - 60℃ </li><li>複合ベンゾインチンキとアルコールの準備を綿棒でマウスの皮膚をきれいにします。 </li><li>後で縫合のために同じ位置を維持するために、マウスの背中の上に行をマーク。 </li><li>アイリスのハサミとピンセットを用いて、マウス上部の背面に直径1.2 cm程度の円形創傷床をカット。滅菌ガーゼのスポンジを創傷床をカバーしています。 DMEM 5mLに丸いマウスの皮膚を置く、それは完全に凍結するまで液体窒素の容器のまま。霜取りは、ホットプレートの上にお湯の管が完全に融解するまで。 3回繰り返します。 </li><li>皮膚のトランスウェルを使用して外科ブレードから再構築し、非常に慎重に膜を除去デタッチ、創傷床の上に（上表皮側）を再構築皮膚を転送する。 </li><li>皮膚の再構築の上にマウスの皮膚（上表皮側）を配置します。 </li><li>マウスの皮膚を修正するためにして、以前にラベルを付けたマーカーの最初の縫合、底部の2番目、両側にある2個以上の縫合を行う。 </li><li>移植後のクリーンマウスの皮膚。ノーズコーンを外し、目を覚まし、外来まで加熱パッド上でマウスを保持します。 </li><li>新しいケージにマウスを置く。 </li><li>手術直後は皮下注射、手術後24時間および48時間でメロキシカム（1 mg / kg体重）：手術鎮痛を投稿。 </li></ol></li></ol> 2。代表的な結果： 皮膚は、正常メラノサイトと皮膚幹細胞で再構築 皮膚は、インサート付き特別6穴トレイで培養され再構築されます。皮膚コンパートメントは、最初の4日間（図1A）のために10％FBSを含むDMEM中で培養される。皮膚は、角化細胞がメラ​​ノサイトまたはメラノーマ細胞（図1B）を播種しているときに私が使用されている培地再構築。表皮は、9日目で空気にさらされると、これは角化細胞が分化することができます（図1C）されています。 18日目で、皮膚の表皮は、階層化ケラチノサイトの層で構成されて再構築。未分化基底層と連続して差別化された層は、（図1D）に縦に並んでいます。染色メラノサイトのマーカーS100で再構築のセクションを覆うとそのメラノサイトがデンドライト拡張機能を介して複数のケラチノサイトと表皮と通信の基底層（図1E）に整列されて表示されます。皮膚コンパートメントは、I型コラーゲンマトリックスに埋め込まれている線維芽細胞が含まれています。堆積コラーゲンIVは、真皮（図1F）から表皮を分離する基底膜を、示している。皮膚幹細胞（GFPレンチウイルスベクターで標識）コラーゲンIマトリックスの線維芽細胞に埋め込まれている場合、それらは表皮に移行し、メラノサイト（1）、（図2）に分化する。表皮のケラチノサイトの複数の層が開発されています。 皮膚は黒色腫の腫瘍の再構築 一般的な買収母斑、異形成母斑、RGP（放射状増殖相）メラノーマ、VGP（垂直増殖期）黒色腫と転移性黒色腫（7）：臨床病理学的研究は、段階的にその黒色腫の進行状況を示します。メラノーマ細胞株の異なる段階では、2次元文化の中でお互いに形態学的に似ています（図3A - D）が、それらが皮膚再構築に組み込まれているときに、細胞の挙動は、彼らの中のin vivoでの特性を反映している。場所と正常メラノサイトの成長率は、しっかりと皮膚の再構築（図3E）で制御されます。 VGPメラノーマWM793は真皮（図3G）に侵襲的に成長するのに対し、RGP主メラノーマWM35は、表皮（図3F）で主に増殖する。転移性黒色腫1205Luは積極的に真皮（図3H）の奥深くまで侵入する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。皮膚は、正常メラノサイトで再構築する。皮膚の肉眼的形態は、ACに示されている再構築する。コラーゲンと混合A.の線維芽細胞を10％FBSおよびフォーム皮膚コンパートメントを含むDMEM中で増殖されています。 B.のケラチノサイトとメラノサイトが真皮の上に播種し、培地を再構築皮膚に成長されています。 C.表皮は、9日目で空気にさらされている。 D. H＆E染色皮膚再構築は、垂直に構成される表皮、指向基底層、および順次分化した層化細胞層を示す。真皮は、コラーゲンI型マトリックス中に埋め込まれた線維芽細胞が含まれています。 E. S100陽性メラノサイト（黒矢印）は、複数のケラチノサイトと基底膜との通信で整列される。 F.コラーゲンIV -染色では、真皮から表皮を分離する基底膜を、示している。 DFのすべてstainingsは、ホルマリン固定、パラフィン包埋切片で行った。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。皮膚の真皮幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化再構築します。5日目に播種ケラチノサイトの後、単一のGFP陽性細胞（緑）が球からの移行を開始。表皮は、まだ単層で構成されています。 8日目では、少数の細胞は表皮 - 真皮のインタフェースに到達する。 10日目では、GFP陽性細胞がしっかりと基底膜の位置に配置されます。移行したGFP陽性表皮エクスプレスメラノサイトのマーカーHMB45の細胞（赤、のような白い矢印で示す）。核はDAPI（青）で染色されています。表皮は、複数の層として開発されています。基底膜は白い点線で示されます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。皮膚は黒色腫のさまざまな段階の再構築：AD。正常メラノサイトおよびメラノーマ細胞は、2次元培養液内で成長する。包皮からAはメラノサイト。 B. RGP WM35細胞。 C. VGP WM793細胞。 D.転移性メラノーマ1205Lu細胞。 E.正常メラノサイトは、基底膜に位置しています。 F. RGPメラノーマWM35細胞は表皮の細胞のクラスターとして成長する。 G. VGPメラノーマWM793細胞が基底膜を介して真皮に侵入。 H.転移性黒色腫1205Lu細胞が積極的に真皮に深く侵入する。 トラブルシューティング<table border="1"><tbody><tr><td> 問題が </td><td> トラブルシューティング </td></tr><tr><td>コラーゲンの混合物は固化していない</td><td>コラーゲンの混合物の色がピンクに藁の黄色でなければならない、そうでなければpHが間違っているとコラーゲンゲルではない場合があります。色は明るい黄色である場合は、より多くの重炭酸ナトリウムは、滴ずつ追加する必要があります。 </td></tr><tr><td>コラーゲンは、途中でmixutureに析出</td><td>コラーゲンの混合物をインサートの上に配置されるまで氷の上ですべてのコンポーネントを置かないでください</td></tr><tr><td>契約コラーゲンは（片側が反対側よりも厚くなる）にもない</td><td>インキュベーターの棚のキャリブレーション</td></tr><tr><td>表皮は、つ以下ケラチノサイトの層が形成されている。 </td><td>下の通路で未分化ケラチノサイトを使用してください</td></tr></tbody></table>

<ol><li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は3次元皮膚の生成で説明している正常ヒトメラノサイト、皮膚幹細胞およびメラノーマ細胞で再構築。単層培養で増殖させた場合、メラニン細胞は、同様の形態（扁平、スピンドルまたは樹枝状の形をした多くの）に関係なく、臨床病期の彼らの起源を紹介。対照的に、3Dの皮膚は、メラノーマ細胞の段階に固有のプロパティを再現再構築します。正常ヒトメラノサイトは、単一の細胞として表皮と真皮層の間の基底膜に存在。より積極的なVGPのメラノーマ細胞は、真皮に基底膜を突破する大規模なクラスタとして成長するのに対し、RGP原発性黒色腫細胞は基底膜に沿って小さなクラスターとして成長する。転移性悪性黒色腫細胞はすべての方向に成長し、単一細胞やクラスタなどの真皮の奥深くまで侵入する。定量分析は、侵入の深さと増殖の程度を測定することにより、このモデル上で行うことができます。正常および悪性メラニン細胞の特性に加えて、我々が直接表皮の基底層にどの家庭、成熟したメラノサイトに皮膚幹細胞の分化を誘導し、E -カドヘリンのアップレギュレーションによってケラチノサイトとの善意の通信を確立できるモデルを用いて（ 6）。 ウイルスベクターを用いて、我々は、アクティブまたはメラノサイトの変換のメカニズムだけではないを研究するために効率的なモデルであることを約束するダイナミクスと皮膚内の各セルの種類によって発現する遺伝子の機能的意義の理解を深める再構築、のために遺伝子機能を不活性化することができますだけでなく、黒色腫（8）の進行。細胞の表現型の長期観測は、皮膚の移植によって免疫不全動物に再構成することが可能となった。このような人間の皮膚 - マウスキメラはmelanomagenesisと黒色腫の転移を研究するために優秀な研究ツールです。 皮膚はまた、薬剤の評価に有用なプラットフォームになることができます再構築します。 2次元培養条件でがん細胞を根絶する多くの薬は、しばしば実験的および臨床応用にはほとんど影響がありません。 in vivoでの腫瘍内に見られるように、3次元培養で黒色腫細胞は多くの場合に応答する細胞2D文化の薬剤に対して耐性である、微小環境は、黒色腫でシグナル伝達経路を調節することを示唆している。成功した創薬のために、3Dの皮膚は、モデルを再構築する生体内で化合物（9,10）の効果を予測するために理想的な臨床ツールです。 要約すると、皮膚はモデルがin vitroおよびin vivo試験との間のギャップを埋める再構築。彼らは、遺伝子が形質転換に関与しているのより良い理解につながるとどのように幹細胞がその変革に貢献する。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> 10倍EMEM </td><td>バイオウィテカー</td><td> 12 - 684F </td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td> Hyclone </td><td> SH - 30071.02 </td></tr><tr><td>ウシ腱酸抽出コラーゲン</td><td>器官形成</td><td> 50分の200 </td></tr><tr><td>組織培養6ウェルインサート付きトレー</td><td>器官形成</td><td> 9285 </td></tr><tr><td>ケラチノサイト無血清培地</td><td>ギブコ</td><td> 17005042 </td></tr><tr><td>透析ウシ胎児血清</td><td> Hyclone </td><td> SH - 30079.03 </td></tr><tr><td>組換えヒト幹細胞因子</td><td>フィッツジェラルドインダストリーズ</td><td> RDI - 307 - 255X </td></tr><tr><td>塩基性FGF </td><td>フィッツジェラルドインダストリーズ</td><td> 30R - AF015 </td></tr><tr><td>エンドセリン-3、人間の</td><td>アメリカンペプチド（株） </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td> C - 7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRHバイオサイエンス</td><td> 56430 - 10L </td></tr><tr><td> F12（HAMの） </td><td>ギブコ</td><td> 11765〜54 </td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>シグマ</td><td> H - 0888 </td></tr><tr><td>インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレン（ITES） </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O - Phosphorylethanolamine </td><td>シグマ</td><td> P0503 </td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマ</td><td> A9795 </td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマ</td><td> P - 8783 </td></tr><tr><td>トリヨードサイロニン</td><td>シグマ</td><td> T - 5516 </td></tr><tr><td>新生児ウシ血清</td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10％ホルマリン緩衝液</td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td>最適な切削温度の凍結媒体（OCT） </td><td>桜</td><td> 4583 </td></tr><tr><td>マルチカセット</td><td> Surgipath </td><td> 02293 - BX </td></tr><tr><td> TBS生検の論文</td><td>トライアングル医歯薬学総合研究</td><td> BP - B </td></tr><tr><td> TBS生検の論文</td><td>トライアングル医歯薬学総合研究</td><td> BP - B </td></tr><tr><td>使い捨てのベース金型</td><td>フィッシャー</td><td> 15から182 - 501C </td></tr><tr><td>複合ベンゾインチンキ</td><td>プロの使い捨て、株式会社、 </td><td> S42450 </td></tr><tr><td>アルコールプレップ綿棒</td><td> CVS薬局</td><td></td></tr><tr><td>シルクブラック編組5から0 </td><td>エチコン</td><td> 682G </td></tr><tr><td>ガーゼのスポンジ（無菌） </td><td> CVS薬局</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td>外科ブレード</td><td>フェザー</td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ麻酔</td><td> Euthanex株式会社</td><td></td></tr><tr><td> SCIDへアレス非近交系マウス</td><td>チャールズ川</td><td></td></tr></tbody></table>

三次元ヒト皮膚は、モデルを再構築：ノーマルスキンとメラノーマ進行を勉強するツールを

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

累積証拠は、その細胞は、それらが3次元細胞外マトリックス内で栽培されている時に異なった動作をしても、他のセル（1-5）と相互作用を示唆しながら、実験的な皮膚の生物学のin vitro試験でほとんどは、2次元（2D）モノカルチャーで行われている。マウスモデルは、広く生体内の組織の形態形成を研究するために利用されている。しかし、マウスとヒトの皮膚は、それが困難なヒトへのマウスの研究を推定するために行う細胞構造と生理機能に大きな違いを、持っている。マウスの皮膚のメラノサイトが主に毛包にローカライズされているので、それらは主に表皮の基底層で見つけている人間のもの、とは異なる生物学的性質を持っている。 3Dヒト皮膚再構築モデルの最近の開発は、異なる種類の細胞の間で細胞 - マトリックスと細胞間相互作用を調査するフィールドを有効にしています。コラーゲンIマトリックス、層化、差別化されたケラチノサイトおよび真皮から表皮を分離する機能的な基底膜、から構成されている&quot;表皮&quot;、に埋め込まれている線維芽細胞と&quot;真皮&quot;で構成されて再構築。コラーゲンは、足場、栄養配信、および細胞間相互作用の可能性を提供します。メラニン細胞がメラ​​ニン細胞恒常性と人間の皮膚のメラノーマ進行の自然の特徴を再現組み込んだ3次元皮膚モデル。 in vivoで同様に、再構成された皮膚のメラノサイトは、基底層のケラチノサイトが散在基底膜に局在している。メラノーマ細胞は、in vivoで 、元の腫瘍の病期（RGP、VGPおよび転移性メラノーマ細胞）を反映して、同じ特性を示す。最近、皮膚幹細胞は、ヒトの真皮（6）において同定されている。これらのマルチ強力な幹細胞は、表皮に移行し、メラノサイトに分化することができます。

このレポートでは、我々は三次元皮膚がアーキテクチャと構成に人間の皮膚を模倣したモデルを再構築について説明します。メラノサイト生理学、メラノーマ進行や皮膚幹細胞の運命は、皮膚、モデルの再構築を使用して検討されている。モデルはまた、薬剤の評価のための前臨床ツールとして有用である。

実験皮膚生物学におけるin vitro研究のほとんどは2次元（2D）単一培養で行われてきたが、蓄積されつつあるエビデンスは、細胞が...

この手順の総合的な目的は、メラノサイト、メラノーマ、および皮膚幹細胞生物学の研究のために、ヒト皮膚の3D再構成モデルを作製することです。これは、まず組織培養トレイのインサートを中和したウシコラーゲンでコーティングすることによって達成されます。次のステップでは、線維芽細胞とコラーゲンを用いて細胞性真皮層を作製します。次に、ケラチノサイトにメラノサイトまたはメラノーマ細胞を混合し、表皮コンパートメントを作製します。本手順の最終ステップは、18日目に皮膚再構築物を回収し、それをマウスに移植することです。最終的に、移植片の免疫組織化学的および免疫蛍光分析により、メラノサイトを含む正常皮膚の構造、正常幹細胞の遊走と分化、およびステージ特異的なメラノーマの表現型が示されます。私たちは20年前に皮膚再構築モデルを開発しました。というのも、研究の初期段階で、ディッシュ上で培養された通常のメラノサイトやメラノーマ細胞は、組織コンテキスト内に存在する細胞とは非常に異なる挙動を示すことが分かったためです。したがって、皮膚再構築モデルは、細胞が皮膚の一つのコンパートメントから他の場所へどのように移動するかを観察するのに理想的です。あらかじめ調製した無細胞層コラーゲン混合物を氷上で準備し、6ウェルプレートの各インサートに淡黄色の溶液を1 mLずつ加えます。ウェル付き組織培養プレートを室温で30分間インキュベートし、ゲルを凝固させます。この間に、ゲルが凝固するにつれて溶液の色が黄色からピンク色に変化します。0.25% trypsin EDTAを用いて、培養フラスコからヒト線維芽細胞をトリプシン処理し、5分後に回収します。10% FBSを含むDMEMを添加し、トリプシン化反応を停止させます。室温で200 Gで5分間遠心分離し、剥離した細胞を回収します。その後、10% FBSを添加したDMEMを用い、1.5 mLあたり4.5×10⁵ cellsの濃度で細胞を再懸濁します。次に、あらかじめ調製しておいた細胞層コラーゲン混合液を50 mLチューブに満たし、チューブを氷上に置きます。線維芽細胞懸濁液を1.5 millilitersチューブに加え、十分に混合する。わら色の細胞層溶液を3 millilitersずつ、細胞外マトリックス層でコートした各インサートに加える。その後、組織培養トレイを5% carbon dioxide組織培養インキュベーター内で37 degrees Celsiusで45分間インキュベートする。細胞層溶液の色も、黄色からピンク色に変化するはずです。上層のゲルが凝固した後、組織培養トレイ内のインサート内部に10%FBSを含むDMEMを2 mL、インサート外部に10 mL添加します。組織培養トレイを4日間インキュベートします。培養4日目にゲルの収縮を確認し、各インサートの内側と外側から培地を吸引します。インサートの内側に2 mL、外側に10 mLの洗浄用培地を加え、通常血清を洗い流します。その後、表皮を形成させるため、トレイを37 °Cで1時間インキュベートします。まず、ヒト角化細胞をトリプシン処理します。その後5分後、分離した細胞を 200 G で5分間遠心分離し、大豆トリプシンインヒビターを用いてトリプシンを中和します。その後、細胞ペレットを再懸濁し、皮膚内で 4.17 × 10⁶ cells/mL の濃度に調整します。ケラチノサイトを回収した後、培地1を再構成します。ヒトメラノサイトをトリプシンで1〜2分間処理します。その後、大豆トリプシンインヒビターを用いて再びトリプシンを中和します。その後、前と同じ条件で細胞を遠心分離し、メラノサイトペレットを皮膚用再構築培地1を用いて 8.3 × 10⁵ cells/mL の濃度で再懸濁します。再構築培地1も同様に調製してください。次に、作製した真皮層組織培養トレイの各インサートの内側および外側から洗浄培地を除去します。各インサートの内側に1.5 mL、外側に10 mLの皮膚再構築培地を加え、洗浄液と交換します。次に、600 µLのケラチノサイト細胞懸濁液と600 µLのメラノサイト懸濁液を混合します。この混合細胞懸濁液を200 µLずつ分注します。各インサートの内側に1滴ずつ滴下します。組織培養トレイを37°Cで2日間インキュベートします。細胞のインキュベート後、各インサートの内側と外側の両方から皮膚再構築培地1を吸引し、次に皮膚再構築培地2をインサートの内側に2 mL、外側に10 mL加えます。その後、再構築物を37 °Cでさらに2日間インキュベートします。2回目の2日間のインキュベーション後、各インサートの内側と外側からskin reconstruct medium twoを吸引します。次に、インサートの外側にのみ7.5 mLのskin reconstruct medium threeを加えます。再構成体をインキュベーターに戻し、培地を交換します。18日目まで、2日おきに再構成体用培地3に交換してください。培養18日目に、皮膚再構成体が配置された組織培養トレイのインサート内部および外部から培地を吸引します。ピンセットを使用して、トレイからインサートを取り出します。メスを用いて、ポリカーボネートフィルターを含む構築物の縁に沿って円を描くように切り出します。次に、フィルター上の構築物を硬い平面に置き、メスで半分に切断します。再構築物の半分を黒色のTBS生検用紙に載せ、その用紙を組織カセットに入れます。カセット全体を10% formalinに4時間以上浸します。その後、カセットを70% ethanolに入れ、再構築物をパラフィン包埋処理するまで4 °Cで保存します。再構築したサンプルの残りの半分を、4°Cで1〜2時間、50% sucroseに浸します。その後、sucroseを2 Mに変更し、さらに4°Cで1〜2時間保存します。ベースモールドの半分まで、最適切断温度包埋剤（OCT）を満たします。気泡が入らないように注意してください。ピンセットで再構成体の端を掴み、ショ糖溶液から取り出します。ショ糖が吸収されるまで、キムワイプの上に置いてください。ピンセットとスパチュラを用いて、再構築組織をOCT上のボートに転送します。ボートがいっぱいになるまで、再構築組織の上からさらにOCTで覆います。この際、同様に気泡が入らないように注意してください。OCTを完全に凍結させるため、ボートを砕いたドライアイスの上に均等に配置します。その後、ベースモールドとホイルで包み、クライオスタットで切断するまで-70 °Cで保存します。マウスへの皮膚再構成物の移植準備として、容器に液体窒素を満たし、50 mLチューブに5 mLのDMEMを加えます。ビーカーに水道水 600 milliliters を満たし、ホットプレートの上に置いて温めます。次に、生後約6週齢の雌のskidヘアレスアウトブレッドマウスを選択します。マウスをイソフルランで麻酔させた後、処置の間、ノーズコーンを使用して麻酔を維持します。無菌の眼用潤滑剤を塗布し、低体温症を防ぐために保温処置を行います。次に、コンパウンドベンゾインチンクチャーとアルコール綿でマウスの皮膚を清浄します。後で縫合する際に同じ位置を維持できるよう、マウスの背中の上部に線をマークします。アイリス剪刀とピンセットを用いてマウスの背中に円形の創傷部位を作成し、その後、創傷部位を滅菌ガーゼスポンジで覆います。切り出した円形のマウス皮膚をDMEMが入った50 milliliterチューブに入れます。チューブを液体窒素容器に浸し、培地と組織が完全に凍結するまで待ちます。次に、チューブを温水のビーカーに入れ、完全に融解するまで解凍します。この凍結・融解の手順を3回繰り返します。外科用メスを使用して、インサートから皮膚再構築物を剥離させます。膜を非常に慎重に取り除き、皮膚再構築物をマウスの創傷床の上に転移させます。次に、マウスの皮膚を皮膚再構築物の上に被せます。最初の縫合糸が先にラベル付けしたマーカーの上に、2番目の縫合糸が下に位置するようにしてください。次に、皮膚再建部位の両側にさらに2本の縫合糸を用いて、マウスの皮膚を固定します。移植後にマウスの皮膚を洗浄し、マウスを新しいケージに移します。18日目。皮膚再構築物の表皮は層状のケラチノサイト層で構成されており、未分化な基底層と、それに続く分化層が垂直方向に並んでいます。再構築物の切片をメラノサイトマーカーで染色します。黒い矢印で示されたS 100により、メラノサイトが表皮の基底層に配列し、樹状突起を介して複数のケラチノサイトと相互作用していることがわかります。真皮層には、沈着したコラーゲンI型マトリックスに埋め込まれた線維芽細胞が含まれています。コラーゲンIVは、表皮と真皮を隔てる基底膜を示しています。以下の図では、表皮においてケラチノサイトがどのように多層化して発達するかを説明します。GFPレンチウイルスベクターで標識した真皮幹細胞を線維芽細胞と共に埋め込んだ場合、コラーゲンI型マトリックス中でそれらは表皮へと遊走し、5日目にメラノサイトへと分化します。角化細胞を播種すると、単一細胞がスフィアから遊走し始めます。表皮は依然として単層で構成されていることに注意してください。8日目になると、少数の細胞が表皮と真皮の界面に到達します。10日目までには、ここで見られるように、GFP陽性細胞が基底膜の位置に密に並びます。表皮内に遊走したGFP陽性細胞は、メラノサイトマーカーであるHMB 45を発現します。皮膚再構築モデルに異なる段階のメラノーマ細胞株を組み込むと、細胞の挙動はそのin vivoでの特性を反映します。この図では、2D培養で増殖させた正常メラノサイトとメラノーマ細胞が確認できます。ここに見られるように、皮膚再構築物における正常メラノサイトの位置と増殖速度は厳密に制御されています。また、放射状増殖期の原発性メラノーマは主に表皮内で増殖しますが、垂直増殖期のメラノーマはこの図に示すように真皮へと浸潤性に増殖します。最後に、転移性メラノーマが真皮深層へと侵襲的に浸潤する様子がここで確認できます。正常皮膚における我々の研究は、メラノーマの発生と進行に関する知見を深めるための基盤となります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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