Name: 新生児低酸素症の生化学的測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 学ぶ新生児低酸素症の生化学的測定法。HPLCとGC/MSを用いて血中代謝物を分析し、ヒポキサンチン、キサンチン、尿酸、アラントイン、MDA濃度およびキサンチンオキシダーゼ活性を定量化する手法です。

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<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
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<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
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<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
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<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

メソッドは、新生児低酸素虚血の評価を許可するここで説明する。このプロトコルは存在、あるいは低酸素性虚血の程度の全体的な生化学的な像を得るためにエネルギー（ATP）剥奪のマーカーの測定、酸化ストレス、酸化的損傷、および酵素活性を兼ね備えています。この方法の有用性にもかかわらず、潜在的な制限があります。第一に、それは、アッセイのすべてを実行するのに十分なプラズマを収集するために血液の約1〜2ミリリットルを取ります。これは、大人や子供の問題になることはありませんが、特に新生児、未熟な人で作業する場合、それは問題になります。我々は、アッセイの優先順位付けやサンプル、必要に応じてのいくつかを希釈することによってこの問題を回避する第二に、それはMMDAを合成することは困難です。。しかし、MDAは、内部標準としてMMDAの代用として使用することができます重水素化。 これらの制限があるにもかかわらず、方法は、アンバランス酸化還元ホメオスタシスに関連する新生児低酸素虚血だけでなく、他の疾患を評価する上で有用なツールを提供する説明。また、これらのマーカーのすべては、XOを除いて、監視...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> 6ミリリットルK3E EDTA K3チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> 5702R遠心</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 05413319 </td><td> 13＆16MMアダプタ付</td></tr><tr><td> 1.5ml微量遠心チューブ</td><td>米国サイエンティフィック</td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - アミノプリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td>バリアンキャリー100分光光度計</td><td> Agilantテクノロジーズ</td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td>サバントSpeed​​Vac </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> SC210A - 115 </td><td></td></tr><tr><td>ミクロン遠心フィルターデバイス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC - 18 - Sカラム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC - 18 - S Supelguardカートリッジとホルダー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td>ウォーターズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMSバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL -アラントイン- 5 -13℃、1 -15 N </td><td> CDNの同位体</td><td> M - 2307 </td><td>ロット＃L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td>ピリジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td>アジレントテクノロジー</td><td> G7021A </td><td> 5975E GC / MSのための＃一部</td></tr><tr><td> 3 - Ethoxymethacrolein </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td>ベンゼン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td>ジイソプロピルエーテル</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td>フェニルヒドラジン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

新生児低酸素症の生化学的測定

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

新生児低酸素虚血は、組織の不十分な血液の灌流または酸素の全身欠如によって特徴づけられる。この条件は1-3神経学的障害を含む十分に文書化新生児疾患を引き起こす/悪化させると考えられている。減少アデノシン三リン酸の生産は、酸化的リン酸化の欠如が原因で発生します。高エネルギーリン酸結合を含むこのエネルギーを奪わ状態の分子を補償するためには2劣化している。これは、最終的に尿酸に、、ヒポキサン​​チン、キサンチンをイノシンに続いて分解されるアデノシンレベルの上昇につながる。この分解過程での最後の2つの手順は、キサンチン酸化還元酵素によって実行されます。この酵素は正常酸素条件下でのキサンチン脱水素酵素の形で存在するが、低酸素-再灌流障害の状況4、5の下にキサンチンオキシダーゼ（XO）に変換されます。キサンチン脱水素酵素とは ​​異なり、XOはプリン劣化4、6の副生成物として過酸化水素を生成します。低酸素時に生成される他の活性酸素種（ROS）と組み合わせて、この過酸化水素は、アラントインを形成するために尿酸を酸化し、マロンジアルデヒド（MDA）7-9を生成する脂質膜と反応する。 ほとんどの哺乳類は、人間が免除、どの酵素ウリカーゼを、持っているアラントインに尿酸に変換されます。ヒトでは、しかし、アラントインは尿酸のROSを介した酸化により形成することができます。このため、アラントインは、ヒトの、ではなく、ウリカーゼを持っている哺乳動物における酸化ストレスのマーカーであると考えられている。 我々は、新生児低酸素虚血の生化学的マーカーを測定するために、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）及びガスクロマトグラフィー質量分析（GCMS）を用いる方法を説明します。 ヒトの血液はほとんどのテストのために使用されます。ウリカーゼ生成されたアラントインの可能性を認識しつつ、動物の血液を使用することもできます 。プリン代謝は1963年、早ければ低酸素症およびヒポキサンチン、キサンチンの信頼性にリンクされていた、と新生児低酸素症の生化学的指標としての尿酸はいくつかの研究者10月13日によって検証した。プリン化合物の定量に用いるHPLC法は、高速で信頼性、および再現性です。アラントイン、酸化ストレスの比較的新しいマーカーの定量化に使用するGC / MS法は、グルーバーら 7から適応されました。このメソッドは、特定のアーティファクトを回避し、試料の少量を必要とします。 MMDAの合成に使用される方法は、他の場所に14 15を説明された。 MDAのGC / MSによる定量がParoni らから翻案されました。とCighetti ら 16、17。キサンチンオキシダーゼ活性はisoxanthopterin 18にプテリンの変換を定量化することによってHPLCにより測定した。このアプローチでは十分な感度と再現性であることが判明した。

メソッドは、新生児低酸素虚血の生化学的マーカーを測定するために記述されています。アプローチは、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）およびガスクロマトグラフ質量分析法（GC / MS）を利用しています。

新生児低酸素虚血は、組織への血流灌流の不足、または全身性の酸素欠乏を特徴としています。この状態は、...と考えられています。

本実験の全体的な目的は、新生児低酸素性虚血の生化学的マーカーを測定することである。まず、乳幼児から血液サンプルを採取して血漿を分離する。次に、血漿の一部をろ過し、内部標準物質と混合した後、HPLC 2を用いてヒポキサンチン、キサンチン、および尿酸の濃度を分析する。その後、さらに複数の血漿分注試料を、それぞれ異なる方法で処理し、個別に分析します。GCMSによるアラントニン濃度およびMDAレベルの測定では、手順の最終ステップとして、反応を停止させた後、血漿の一部と基質を混合して酵素反応を開始させます。キサンチンオキシダーゼの活性は、蛍光検出器を備えたHPLCで測定することが可能です。最終的に、ピーク面積のクロマトグラムが得られ、これを標準曲線を用いて目的のバイオ化学マーカーのモル濃度や酵素活性に変換することができます。この手法は、エネルギー欠乏、酸化ストレス、酸化損傷のマーカー、および酵素活性の測定を組み合わせることで、低酸素虚血の有無やその程度までを含む全体的なバイオ化学的状況を提示できるため、新生児低酸素虚血の治療および診断への応用が期待されます。本手順を開始する前に、出生後5分以内に、新生児から6 mLのEDTA管を用いてヒト血液サンプルを採取します。採取後、サンプルを4 °C、1,500 ×gで10分間遠心分離します。上清にある血漿を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、30分間遠心分離します。赤血球でサンプルを汚染しないよう注意しながら、上清を除去します。各PLCのプリン測定のため、サンプルをピューリニン、MDA、およびキサンチンオキシダーゼ分析用の個別のマイクロ遠心チューブに分注します。血漿200 µLを遠心フィルターデバイスに移します。血漿を4 °C、14,000 ×gで1.5時間遠心分離します。ろ液を取り除き、2つのaino purineを含むマイクロ遠心チューブに移します。濃度を正確に決定するため、2つのAPを含むマイクロ遠心チューブに加えたろ液の量を必ず記録してください。チューブを10〜20秒間ボルテックスします。書面によるプロトコルに従い、各サンプルにつき50 µLの注入を3回行い、HPLCでサンプルを分析し、得られたクロマトグラムを用いて解析します。サンプル中のプリン体の濃度を決定してください。対応する保持時間と波長におけるピーク面積を算出することで、ヒポキサンチン、キサンチン、および尿酸を定量します。次に、2つのapのピーク面積を定量します。この情報から、ハイパーキサンチンおよび尿酸の2つのAPに対する面積比を算出できます。その後、標準曲線を用いて比率をマイクロモル濃度に変換します。ラニンを測定するには、50 µLの血漿に50 µLの内部標準物質と100 µLのアセトニトリルを添加します。混合物を10～20秒間ボルテックスした後、10

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新生児低酸素症の生化学的測定

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