Name: 部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 学ぶ部分的膵切除患者からのヒト膵島単離法。酵素消化と密度勾遠心分離を用いて、2型糖尿病および非糖尿病患者の膵島を取得し、機能解析のためのin vitro系を構築する技術を解説します。

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我々は、プロジェクトのさまざまな段階で助け、アドバイスと重要な入力を提供する私たちの多くの同僚に感謝したいと思います。このビデオの記事の生産は、教育と研究のためのドイツ省（BMBF）から糖尿病研究のためのドイツ語センター（DZDへの資金でサポートされていました<a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> IMIDIA（、） <a href="http://www.imidia.org">のhttp://www 。imidia.org</a> ）と技術ドレスデンの大学の大学病院カールグスタフケーラス。これらの結果につながる研究は、助成金協定N ° 115005の下で革新的医学イニシアティブに関する欧州共同体の第七次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）から資金を受けています。

1。手術室における膵組織のコレクション<ol><li>外科医は、膵臓の部分切除を行います。 </li><li>氷の上にボックスで膵臓試料を配置した後、病理医にすぐにそれを提供します。 </li></ol> 2。膵島分離のための組織の選択<ol><li>病理医は、診断目的のために損傷した組織を維持し、柔らかで健康的に表示される組織を選択します。線維化組織と使用可能な組織の未満2gを提供する標本は膵島分離から除外されます。 </li><li>ユーロコリンズ液における膵組織を浸漬し、実験室に氷の上で実現。 </li></ol> 3。ヒト膵島の単離<ol><li>膵臓の組織を比較検討し、10cmの皿に入れてください。 </li><li> 500mlのフラスコに150ミリリットルRPMI培地を入れて。 </li><li> 250mlのフラスコに、100 mg / mlのDNaseおよび5mg/mlリベラーゼRIの20mlで130ミリリットルRPMI媒体を組み合わせることにより、消化酵素溶液を調製。膵臓の組織を注入するシリンジにこの溶液10mlを描く。 </li><li>均一に膨張させることを目指し、膵組織に消化酵素溶液を注入。これは線維化が禁止されている場合は、消化が失敗する可能性があります。次に、〜4ミリメートル氷の上に3つの部分にティッシュを飾らない。 </li></ol> 4。ヒト膵臓の消化回路<ol><li>図1に示すように、消化の回路を組み立てます。 Ricordiのチャンバ内の流れ方向は、チャンバーの上部の底とアウト時になります。 </li><li> 300mlの総容積を500 mlのフラスコに、残りの消化酵素溶液を追加し、温度計を挿入する。 </li><li> 、チャンバー内に膵組織を転送するメッシュ（孔径：600μm）を挿入する三窒化ケイ素ビー玉（直径：15 mm）を、チャンバーを閉じ、140ml /分で設定流量でポンプを起動します。 </li><li>回路の温度が37℃に達すると、タイミングを開始し、定期的に消化を停止する時期を決定するためにサンプルを取る。ジチゾン（濃度2μg/ ml）で染色すると消化された組織4内の膵島の微視的な可視化が可能になります。 </li><li>小島が周囲の腺房組織から分離されると、氷の上で加熱コイルを配置し、回路へのコールド洗浄媒体200mlの（5.5 mMグルコース及び10％FBSと900ミリリットルRPMI 1640）を追加することで消化を迅速に停止する。 </li><li>それはサンプルチューブから出てくると250 mlコニカルチューブに膵島ソリューションを収集する。回路が空になるまで続けます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。三窒化ケイ素のビー玉（直径：15ミリメートル）： ヒト膵臓の消化回路は、ヒト膵臓の消化回路は、メッシュ（600μmの孔径）を含むRicordiのチャンバーが含まれています。チャンバーからの流出は、蠕動ポンプ（140ml /分）により、組織のコレクションのフラスコに駆動されます。矢印は流れ方向を示している。酵素消化のための最適温度は37℃の水浴中で加熱コイルを浸漬することにより維持されています。 5。後の消化を洗浄<ol><li> 5分間1000rpmで膵島ソリューション、4 ° Cを含む250ミリリットルコニカルチューブを遠心する。 </li><li>上清を捨て、（5.5 mMグルコース及び10％FBSを900ミリリットルRPMI 1640）洗浄媒体の膵島ペレットを再懸濁し、50 mlコニカルチューブに等しい分数にそれを配布する。 （オプション：洗濯を向上させるために追加のコニカルチューブに配布します。）遠心は1000rpmで、4℃で5分間Cを。 </li><li>上清を捨て、軽くマニュアル揺れによってペレットを緩めます。 </li></ol> 6。フィコール勾配で精製<ol><li> 1.125グラム/ mlの、pH7.4の密度でフィコールメディアでペレットを再懸濁し、ゆっくり1.080、1.060および1.037グラム/ mlの密度でフィコールメディアを10mlのアリコートを重ねます。 </li><li> 20分間4℃、2400 rpmでフィコール勾配を遠心分離します。 </li></ol> 7。膵島コレクションと文化<ol><li>遠心分離後、別の組織成分は勾配で、そのパーティションで区別することができます。 </li><li>脂肪と結合組織から成る上部層を捨てる。 </li><li>慎重に1.037〜1.060グラム/ mlの相間での膵島集合体の最初の層を収穫。この層は最も純粋な孤立した島が含まれています。効率的な分離のために別々の画分を集める。 </li><li> 1.060〜1.080グラム/ mlの間期における膵島集合体の第二、少ない純粋なフラクションを集める。 </li><li> 50mlの合計量にそれぞれのコニカルチューブに（5.5 mMグルコース及び10％FBSを900ミリリットルRPMI 1640）を洗浄するメディアを追加することにより、フィコール勾配を希釈する。 1000rpmで遠心、5分間4℃。 </li><li>吸引により上清を捨てる。ペレットはルーズフィコール勾配が原因である可能性があるので注意してください。 </li><li>ペレットwiを洗う番目の洗浄媒体（5.5 mMグルコース、10％FBSと900ミリリットルRPMI 1640）と1000 rpmで遠心、4℃で5分間。膵島培養培地を用いて繰り返す</li><li>培地で島を再懸濁し、37℃5％CO 2でインキュベーターの中に置いてください° Cをさらに処 ​​理する前に、24〜48時間。 </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちのプロトコルを使用して、ヒト膵島は、膵部分切除から収集した膵臓組織から単離することができる。このプロトコルの成功は、いくつかの重要なポイントの間に取られた心配に依存しています。 β-細胞生存率を維持するために、それは、試験片を実験室に氷上で急速に輸送されることが不可欠です。さらに、組織の消化の期間は、組織の線維化とメディアの酵素活性の等級に応じて経験的に最適化する必要があります。これはRicordiのチャンバーに手動で適用される機械的な力の程度についても同様です。したがって、良好な膵島収量を得るために、プロトコルは最適​​な、専用の科学者や技術アシスタントによって実行されます。チームはすでに膵島分離に経験されていない限り、初期不良が主流です。 私たちの膵島分離プロトコルと標準的なヒト膵島分離法の主な違いがあります：1）我々は手術中に虚血の数時間を受けた膵臓組織を使用していますが、それはすぐにサイト上で処理されますが。これは、割り当ておよび膵島分離施設への納入時に数時間のために虚血性のまま膵臓/膵島移植のための脳死患者からの外植膵臓とは対照的です。標準プロトコルは、膵管にそれを注入することであるのに対し、2）我々は、膵臓の組織に直接コラゲナーゼを注入する。 3）我々は、代わりにCOBEセルのプロセッサを使用して連続フィコール勾配から膵島を集めるの不連続フィコール勾配を使って島を区切ります。 手術標本があまりにも線維性または膵島の十分な数を単離するための不足しているケースでは、組織はまだレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）10によって取得することができます。これは、膵島分離に失敗した場合でも、遺伝子発現データは、ほぼすべての試料から回収することができますまたは収率が非常に低いです。残念ながら、LCMは、機能的な研究のために生きている細胞を生成しませんし、その量は、プロテオーム解析のための一般的には不十分である。このように、膵島を取得するために私たちのコラゲナーゼ消化プロトコルと並行してLCMを使用すると手術標本を処理するために最も効果的な方法かもしれない。 部分的pancreatectomiesからの膵島分離のために組織を収集する場合、それは患者の病歴や代謝の状態を慎重に調べることが重要です。部分的に膵臓を摘出された患者は、型3C糖尿病、手術6につながる膵臓疾患に続発すなわち糖尿病の影響を受ける可能性があります。 2010年に当科でこの手術を受けた43参加した患者のうち、32は非糖尿病だった、5は2型糖尿病の影響を受け、6種類3C糖尿病を持っていた。これらのデータは、グルコース代謝の障害と膵癌や慢性膵炎6から患っている患者のかなりの割合で糖尿病を指している以前の研究に同意する。それは膵臓の手術7につながる症状の発症前に少なくとも一年と診断された場合、我々は、一次起源であることが糖尿病を考慮。膵島自己抗原に対する抗体のレベルはまた、糖尿病8の潜在的な自己免疫の起源を評価するために測定する必要があります。膵切除術を受けた患者は、未診断の糖尿病を患うまたはグルコース不耐症になる可能性があるため、すべての非糖尿病患者は膵切除9以前に経口ブドウ糖負荷試験を付与する必要があります。

<table border="1"><tbody><tr><th>の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><th>機器</th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25ミリリットル血清ピペット（CELLSTAR） </td><td>グライナーバイオワン</td><td> 760180 </td></tr><tr><td> 10mlのシリンジ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> 50mlのシリンジ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> 5 mlのシリンジ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2ニードルMicrolance 3 </td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2ニードル</td><td>ブラウン</td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4ニードルMicrolance 3 </td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3cmの細胞培養ディッシュ2 × 2 mmの格子</td><td>ヌンク</td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20cmの組織培養皿</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6センチメートルイージーグリップのペトリ皿</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150mlのストレージのボトル</td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250ミリリットルの三角フラスコ</td><td>ショットデュラン</td><td> 21 217 36 </td></tr><tr><td> 500mlエルレンマイヤーフラスコ</td><td>ショットデュラン</td><td> 21 217 44 </td></tr><tr><td> 250mlのスクリューキャップコニカル遠心分離管</td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50mlファルコンコニカルチューブ</td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260ミリリットルEasyflask非処理</td><td>ヌンク</td><td> 156800 </td></tr><tr><td>マイレクスGVフィルターユニットDuropore（0,22μM） </td><td>ミリポア</td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td>ボトルトップ吸引フィルター（PES 70ミリメートル直径Membran、0,22μmの孔径、45 mmの首のサイズ、500mLの容積） </td><td>コー​​ニングインコーポレイティッド</td><td> 431118 </td></tr><tr><td>濃度計（Densito 30pxの）LWE37463 </td><td>メトラートレド</td><td> 51324450 </td></tr><tr><td>高速PESフィルターユニット0,2μmの</td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td>加熱コイル</td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> HC - 02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS - R </td><td>ヘレウス</td><td> 75015680 </td></tr><tr><td>ポンプ（標準）PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordiのチャンバー（600μmの孔径を持つ金属製のメッシュ） </td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td>モデル50 - U - 01、シリアル0503から001 </td></tr><tr><td>準備スタンド</td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> 50 - PS - 01 </td></tr><tr><td> O -リング</td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> OR - 50 - U - 01 </td></tr><tr><td>窒化ケイ素のビー玉（9、15 mmのセット） </td><td> BioRepテクノロジーズ株式会社</td><td> SN - 01 </td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>タイゴン</td><td> R 3603 8,0 X4、0ミリメートル</td></tr><tr><td>手術用鉗子</td><td>ブラウン</td><td> BD168R </td></tr><tr><td>外科はさみ（Aesculap） </td><td>ブラウン</td><td> BC273R </td></tr><tr><td>水浴OLS 200 </td><td>グラント</td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th>試薬</th><th></th><th></th></tr><tr><td>コラゲナーゼ - &gt;リベラーゼのRI（100 mg）を</td><td>ロッシュ</td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D（+） - グルコース</td><td>メルク</td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド（DMSO） </td><td>メルク</td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone（DTZ） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNアーゼI（100 mg）を</td><td>ロッシュ</td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA研究所</td><td> H15 - 002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清（FBS） </td><td> PAA研究所</td><td> A15 - 101 </td></tr><tr><td>フィコール400 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F9378 </td></tr><tr><td>胎児ウシ血清（FBS） </td><td>ギブコ</td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - （4 - （2 - ヒドロキシエチル） - 1 - ピペラジニル）- ethansulfons‰URE（HEPES） </td><td>ロート</td><td> 9105.3 </td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、5 M </td><td>臨床薬学、病院</td><td> - </td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン（100倍） </td><td> PAA研究所</td><td> P11 - 010 </td></tr><tr><td> Pipettaid（EXPRESS） </td><td> BD（ベクトンディッキンソン社） </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlo​​rid </td><td>フルカ</td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate無水</td><td> JTベイカー</td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JTベイカー</td><td> 3246〜01 </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 [ - ] D -グルコース[+] L -グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 [+] L -グルタミン</td><td> PAA研究所</td><td> E15 - 840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td>メルク</td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> メディアとソリューションジチゾン溶液<ul><li> 10ミリリットルのDMSOに100 mgのDTZを溶かし、40 mlのPBSで希釈</li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>酵素ソリューション<ul><li> 20ミリリットルRPMI 1640培地中に100 mgのリベラーゼRIを（サプリメントなしで）溶かす</li><li> （サプリメントなし）を1ml RPMI 1640培地で100mgのDNaseを溶かす</li><li>滅菌フィルターソリューション（0.22μm）と氷上で酵素を保つ</li></ul>ウォッシュメディア（1000ml/5.5mMグルコース） <ul><li> 100ミリリットルFBSを（熱不活性化）に溶かし</li><li> 450ミリリットルRPMI 1640（無糖）を追加</li><li> 450ミリリットルRPMI 1640（11 mMグルコース）を追加する</li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>膵島培養培地（5,5 mMグルコース/ 500ミリリットル） <ul><li> 10ミリリットル1M HEPES（pH7.4）を溶解する</li><li> 50ミリリットルFBSを追加</li><li> 5ミリリットルペニシリン/ストレプトマイシンを（100倍）を追加</li><li> 2.75ミリリットル1 Mグルコース溶液を追加</li><li> 432.25ミリリットルRPMI 1640（無糖）を追加</li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>ユーロコリンズ液<ul><li> 4083グラムのカリウムの水素</li><li> 70,0 gのグルコース</li><li> 2237グラムの塩化カリウム</li><li> 14,80 gのカリウム一水素</li><li> 1680グラムの炭酸水素ナトリウム</li><li> 40mlの電解質溶液（E 154） </li><li> pH7.4の</li><li> 2000ミリリットルの蒸留水を追加します。 </li><li>滅菌フィルター溶液（0.22μmの） </li></ul>フィコールストック溶液<ul><li> 500グラムフィコールにユーロコリンズ液1000 mlを加え</li><li> 8.94グラムのHEPESを追加</li><li>フィコールが解決するまで一晩撹拌する</li><li> pH7.4の</li><li>密度を測定</li></ul>フィコール勾配<ul><li>密度に応じてFBSの量、ユーロコリンズ液やフィコールストックソリューションを計算する</li><li> 3ソリューションを組み合わせて、濃度計で濃度を測定</li><li>密度が調整されるまで、ユーロコリンズ液やフィコールストックソリューションを追加します。 </li><li>滅菌フィルタ4での解（0.22μm）とストアは、° C </li></ul>

部分的に膵臓を摘出された患者からのヒト膵島の単離

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

2型糖尿病とランゲルハンス故障1の島の病因の調査は、臓器提供者2からの2型糖尿病膵島の限られた可用性によって妨げられている。ここでは、2型糖尿病と異なる膵疾患（良性または悪性膵腫瘍、慢性膵炎、および総胆管や十二指腸腫瘍）による膵部分切除を受けた非糖尿病患者から得られたヒト膵組織からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有する。関係するすべての患者はまた、地元の倫理委員会によって承認されていたこの研究に同意を与えた。手術標本は、直ちに診断目的のために損傷した組織を維持し、膵島分離のために柔らかで健康的に出現する膵組織を選択した病理医に届けられました。我々は1,000以上の島を分離することがわかった、我々は、膵組織の少なくとも2gを開始しなければならなかった。我々のプロトコルにも不可欠の酵素含有培地を注入するときに目に見えて組織を膨張させると、続いて表面積を増やすことによって消化を助けるためにそれをミンチにしました。 ヒト膵臓組織の大量（&gt; 15グラム）が使用できる偶発症例を含めるために、我々のプロトコルの適用性を拡張するために、我々は組織を消化するためにRicordiのチャンバー（50ml）を使用。消化中に、我々は、手動で組織の線維化のそのレベルに応じて試料によって変化する強度でRicordiのチャンバ3を横に振った。不連続フィコール勾配は、その後、腺房組織から膵島を分離するために使用されていました。我々は、組織ペレットが均一に1.125グラム/ mlの密度でフィコール培地に再懸れるのに十分小さくする必要があることに注意。単離後、我々は彼らの機能回復を促進するために、少なくとも48時間、37時、5％CO 2でストレスフリーの条件（無揺れや回転）° C下で膵島を培養。我々のプロトコルとその将来の改良の広範なアプリケーションが大幅に2型糖尿病の研究を進め、糖尿病と臨床的にマッチした非糖尿病患者からヒト膵島の大量のタイムリーな収穫を有効にすることができます。

これは非常に大きく線維化とコラゲナーゼ活性の違いに起因する準備の間で変化が我々のプロトコルには、膵組織のグラムあたり〜500膵島の平均が得られた。私たちは、その後24時間分離した後、それらをhandpicking、組織の処理中に、ジチゾンを持つ最初の染色により&gt; 90％の膵島の純度を達成しました。精製された膵島の品質を決定するために、我々は、2時間静置条件下で25 mMのグルコース刺激によるインスリン分泌のためにテストされています。我々はECIT膵島分離および移植センターから得られた島に匹敵するインスリンの分泌を発見した。部分的に膵臓を摘出された膵臓から分離された島が膵島移植のために意味されないので、合計IEQのアセスメントは重要な要因であると考えられていなかった。 重要なことは、私たちの方法は、私たちは2005年から2008年5〜25部分的な膵臓を摘出された患者からの機能研究のために膵島を分離することができました。これらの島は、ウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学によってグルコース刺激インスリン分泌および特定のタンパク質の発現について分析した。部分的にpancreatecomized膵臓から分離した膵島を、また、非糖尿病および糖尿病膵島の超微細構造外観と機能的反応を遺伝子やタンパク質発現プロファイルを比較するために使用することができる。臓器のドナーが存在するよりも、膵部分切除を受けて、より多くの患者が存在するため、我々のプロトコルは、十分なサンプルとデータを堅牢な統計分析のために収集される可能性があります。

研究のための2型糖尿病膵島の供給が不十分です。ここでは、膵部分切除を受けた患者からの膵島を単離するための我々のプロトコルを共有しています。このアプローチは、2型糖尿病と基礎および臨床研究のための十分な数の臨床的にマッチした非糖尿病患者からの膵島を得るためのユニークな会場を表します。

2型糖尿病の病態およびランゲルハンス島機能不全1に関する研究は、2型糖尿病の利用可能なモデルが限られていたため、妨げられてきました。

こんにちは。トリトン工科大学外科部のFlorian Alです。こんにちは。グレイストンの大学病院外科部のGregor Cherです。まぶたの生物学および機能に関する研究は、まぶたの生理学および糖尿病の病態生理の理解を深めるために切実に求められています。残念ながら、非糖尿病患者および2型糖尿病患者からヒトのまぶたを入手することは非常に困難です。以下のビデオシーケンスでは、膵臓部分切除術を受けた患者からヒトのまぶたを単離するためのプロトコルを紹介します。このように得られたアイレット（島組織）は、機能解析のためのin vitroシステムとして利用可能です。ヒトアイレットを単離するためには、ヒト膵組織の外科的切除が前提となります。本手法では、特定の膵疾患により膵臓の部分切除を受ける患者から組織を提供してもらっています。ヒト膵臓組織のソースとして、外科医が膵臓を切開し、部分切除を行います。その後、摘出された膵臓は氷上に置かれ、病理学部門に運ばれます。病理医は、採取すべき健康的に見え、かつ軟らかい膵臓組織の量を決定します。アイレット（eyelid）の分離には、少なくとも2 gの膵臓組織が必要です。組織はUcon溶液に入れられ、氷上で研究室まで運搬されます。アイレット分離施設での最初のステップは、膵臓組織の重量を測定することです。次に、サンプルを10 centimeterのディッシュに入れます。あらかじめ、150 milliliterのRPMI培地を入れた500 milliliterフラスコ1本と、130 milliliterのRPMI培地を入れた250 milliliterフラスコ1本を用意しておきます。その後、1 milliliterのDNAsと20 milliliterのコラゲナーゼを含む消化酵素溶液を250 milliliterフラスコに加え、それを10 milliliterシリンジで吸い上げます。洗浄した膵臓組織に酵素を含む培地を注入して拡張させ、その後、表面積を増やして消化プロセスを促進するために細かく刻みます。注入による拡張だけでは組織内に酵素を適切に分布させることができないため、この刻砕ステップが極めて重要となります。これと並行して、消化回路を組み立てました。この図に示すように、記録チャンバー内の流れの方向は、底面から入り、上面から出るようになっています。その後、残りの酵素含有培地を500 mLのフラスコに300 mLの容量まで加え、温度計を挿入します。記録チャンバーには、孔径600 µmの金属メッシュと、直径15 mmの窒化ケイ素マーブルが含まれています。膵臓組織をチャンバーに移し、メッシュを挿入してチャンバーを閉じ、140 mL/minの速度でポンプを始動させます。回路の温度が37 °Cに達したら、消化時間の測定を開始します。組織の組成に応じて、チャンバーを手で振って攪拌します。消化を停止させる最適な時間を決定するため、定期的にサンプルを採取して染色を行い、分離した眼瞼を顕微鏡下で確認します。眼瞼が組織から分離したことが確認されたら、加熱コイルを氷上に置き、回路に200 milliliterの冷洗浄用培地を加えることで、速やかに消化を停止させます。その後、回路が空になるまで、250 milliliterファルコンチューブにサンプルチューブを挿入して眼瞼溶液を回収します。以下の洗浄手順は、4 °C、1000 RPMで5分間の遠心分離ステップから開始します。次のステップでは、上清を捨て、洗浄用培地で沈殿物を再懸濁し、50 mLファルコンチューブに等分して分配します。その後、再び4 °C、1000 RPMで5分間の遠心分離を行い、洗浄を継続します。オプションのステップとして、パレットのサイズに応じて、元の4本に加えてさらにファルコンチューブに分配します。洗浄効率を向上させるため、再度上清を廃棄し、パレットを穏やかに緩めて、眼瞼組織を周辺組織から分離させます。これら2つの部位の組織密度の違いにより、密度勾配遠心法の適用が可能になります。まず、ペレットを密度1.125 g/mLの糞便培地で再懸濁します。均一に再懸濁できるように、ペレットは十分に小さい必要があります。次に、密度1.081、1.060、および1.037の糞便培地を、それぞれ10 mLずつ、ゆっくりと積層させます。その後、密度勾配を4°Cで2,400 RPM、20分間遠心分離します。これにより、分画された各成分を密度に基づいて区別することができます。まず、脂肪および結合組織からなる上層を廃棄します。ここで回収する画分は、1.037および1.06の境界にある眼瞼凝集物の第1層であり、主に単離されたアイレットが含まれています。効率的に単離するためには、各画分を個別に回収することが重要です。次に、1.060と1.080の界面にある眼瞼凝集物の第2層の画分を回収しますが、ここに含まれるアイレットは第1層よりも純度が低くなります。次に、糞便グラジエントを希釈するために洗浄液を加えて全量を50 milliliterとし、1000 RPMで5分間遠心分離します。4 °Cにて、冷温染色の影響でペレットが非常に緩くなる可能性があるため、上清を吸引して除きます。そのため、眼瞼培養培地を用いて、4 °C、1000 RPMで5分間の洗浄ステップを繰り返す必要があります。最後のステップでは、ヒトのアイレットを再懸濁し、アイレットを培養液中で培養します。回収したアイレットを37°Cのインキュベーターで24〜48時間培養します。この培養ステップの後、アイレットはさらなる処理が可能な状態になります。本プロトコルにより、部分膵切除術後の膵臓組織からヒト膵島を単離することができます。細胞生存率を高く維持するためには、採取した膵臓を膵島単離施設まで迅速かつ冷却状態で搬送することが重要です。単離チームは、消化プロセスが非常にダイナミックな procedure であることを留意しておく必要があります。消化プロセスの所要時間は、組織組成に強く依存します。例えば、線維化の程度や、膵組織への十分な酵素注入の可否などが挙げられます。良好なアイレットの回収率を得るには、記録用チャンバー内での機械的な負荷と消化プロセスの時間を個別に調整することが極めて重要です。

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