超音波標的マイクロバブル破壊テクニック入門

UTMDは、超音波標的マイクロバブル破壊（ultrasound targeted microbubble destruction）の略称です。UTMDを用いることで、心臓や肝臓など超音波が到達可能な標的臓器へ、治療用遺伝子を含む生物活性分子を部位特異的に送達させることができます。UTMDでは、目的の遺伝子をコードする負電荷を帯びたプラスミドDNAベクターなどの生物活性分子を、脂質マイクロバブル造影剤の陽電荷シェルに結合させます。こうしてベクターを結合させたマイクロバブルを、静脈内または心臓の左心室に直接投与します。

大型動物では、待機時間を設けるか否かにかかわらず、冠動脈カテーテルを用いて送達することも可能です。その後、循環系から標的臓器への送達は、マイクロバブルの共鳴周波数における音響キャビテーションを通じて最適に行われます。マイクロバブルの崩壊によって生成された機械的エネルギーが、標的領域の微小血管における内皮細胞内または内皮細胞間に、一過性の孔形成を引き起こすと考えられます。

このサウナパリオン効果の結果、内皮細胞へのおよび内皮細胞を通過するトランスフェクション効率が向上し、導入遺伝子をコードするベクターを目的の周囲組織に沈着させることができます。循環系に残存する血漿DNAは、血液マイクロバブル調製液中のヌクレアーゼによって速やかに分解されます。グルコースリン酸緩衝生理食塩水、ジオールグリセロール-3-ホスファチジルコリン、およびジオールグリセロール-3を含む調製済みマイクロバブルストック溶液を分注します。

まず、ホスファチジルエタノールアミンを40 °Cで15分間インキュベートします。次に、温めたマイクロバブル溶液を、グリセロールおよび1〜2 mgの目的遺伝子の発現構築物をコードする精製血漿DNAを含む1.5 mLマイクロチューブに移します。リン酸緩衝生理食塩水を加え、最終容量を500 µLにします。

その後、マイクロチューブ内の空気をオクタフルオロプロパンガスに置換します。次に、マイクロチューブをデンタルアマльгаメータで20秒間激しく振盪させます。初回使用前の装置の校正として、適切な機械的指数（MI）およびパルス反復周波数を確保するために、1 MHzのUTMDキャビテーション変換器を校正する必要があります。

1 MHzの水中トランスデューサを、電力増幅器を介して波形発生器に接続します。トランスデューサを水で満たしたプラスチック容器内に配置し、電荷増幅器を介してオシロスコープに接続したハイドロフォンに直接向けます。波形の周波数、振幅、バーストサイクル、および電力増幅をすべて調整し、マイクロバブルをキャビテーションさせるために最適なデューティサイクルと機械的指数を得ることができます。このセットアップでは、1 MHzのマイクロバブル導入およびUTMDにおける機械的指数が約1.3に相当するようにシステムを校正しました。UTMDC 57 BLのマウス6匹に対し、ケタミン 100 mg/kgおよびキシラジン 5 mg/kgを腹腔内投与（IP injection）して麻酔をかけます。

マイクロバブルの投与は、心臓の左心室への直接注入または尾静脈カテーテルを通じて静脈内に administration されます。心臓への直接注入の手法については後述します。血漿DNAを封入したマイクロバブル溶液を最大100 µL、超音波可視化下で第4肋間前方から挿入した30ゲージ針を用いて心臓の左心室に注入します。左心室への注入によって生じるマイクロバブル溶液のボルスは、マウスの胸部に固定して配置した VisualSonics 高周波超音波トランスデューサを用い、長軸像で可視化します。

注入直後、標的となる臓器の直上に、より小型の低周波1.0 megahertzトランスデューサを保持し、約5分間にわたってマイクロバブルの破壊を行います。超音波は、パルス繰り返し周波数1.0 megahertz、機械的インデックス（MI）約1.3から1.5、パルス繰り返し期間を20サイクルごとに100 millisecondsとして肝臓に照射します。あるいは、マウスのECGに同期させ、4から6心拍周期ごとに3フレームの超音波バーストを照射するようにゲート制御することも可能です。尾静脈によるマイクロバブル投与法では、プラスミドを含むシリンジを用いる場合と同様の方法でマウスを麻酔します。

DNA結合マイクロバブルを27ゲージの針を用いた尾静脈カテーテルに接続します。尾静脈カテーテルを、マウスの尾に沿って走る右または左外側静脈の末端3分の1の部位に挿入します。マイクロバブルが入ったシリンジを輸液ポンプにセットし、あらかじめ設定した一定量の溶液を、設定した時間で自動的に投与します。

UTMDの生物発光分析において、UTMDを介したプラスミドDNA導入の有効性は、構築物にコードされた遺伝子に応じて様々な方法で評価できます。特に、生体内生物発光イメージングは、遺伝子発現の存在と持続期間をモニタリングできる手法の一つです。これは、ルシフェラーゼなどの生物発光レポーター遺伝子をコードするプラスミドを導入したマウスで行われます。

Enogen in vivo イメージングシステムは、バイオルミネッセンスの検出に使用されます。イメージング画像は通常、UTMD介在性トランスフェクション後の1日目にすべてのマウスで撮影し、その後、システムでバイオルミネッセンス遺伝子の発現が視覚的に検出できなくなるまで3〜4日ごとに繰り返し撮影します。バイオルミネッセンスイメージングの準備として、まずマウスにルシフェラーゼレポータープローブであるLuciferを腹腔内（IP）投与します。

その後、マウスを麻酔します。約3分後、Lucifer基質の生体内分布を約10分間進行させ、その後、動物をXeno Genイメージングチャンバーに設置し、全身のイメージスキャンを行います。撮像中、ファイアフライルシフェラーゼの光化学反応から放出される光子がシステムによって検出され、各画像の取得後に決定されます。

Xeno in vivo イメージングシステムを用い、システムソフトウェアを使用して、可視光発光の関心領域（ROI）の測定および定量化を行います。