組み合わせることを使用してターゲットと嗅球の神経細胞インビボでのエレクトロポレーションとGAL4ベースエンハンサートラップゼブラフィッシュの行

本手法では、時間的および空間的に限定したin vivoエレクトロポレーションをゼブラフィッシュのトランスジェニックラインと組み合わせることで、発生中の胚の特定領域を選択的に標的として外来遺伝子を発現させる方法を解説します。まず、エンハンサートラップ法を用いて、目的の細胞型および遺伝子発現を制限したcal TA 4トランスジェニックフィッシュを用意します。本例では、発生における特定の時期の嗅球の発達を対象とし、GFPレポータープラスミドを前脳の前端にin vivoで注入し、エレクトロポレーションを行うことでDNA導入を促進させます。in vivo蛍光イメージングにより得られた結果は、発生の特定の時期および過程において、外来遺伝子が精密に局在していることを示しています。

この手法の既存の手法（1細胞期へのプラスミド注入など）に対する主な利点は、発達中の脳の特定領域における特定の細胞型に限定して発現させることができる点にある。メディエート・エンハンサー・トラップ法によって作製されたゼブラフィッシュのトランスジェニック系統を用い、発達中の脳の特定領域で転写因子 calt A four とレポータータンパク質 M cherry の両方を発現させる。トランスジェニック挿入物のヘテロ接合体である成魚と野生型魚を交配させ、約50%のトランスジェニック個体を得るように設定する。

次に、受精後6〜8時間から、100 µMのPTUで形質転換胚を処理し、色素形成を抑制して、受精後24〜28時間での蛍光イメージングを容易にします。胚をPTUを含まない卵水に移し、蛍光顕微鏡下で、mCherryの発現により形質転換胚を特定します。エレクトロポレーションバッファーとトリカに低融点アガロースを加えた0.5%溶液を調製し、溶液を平衡化させます。

34から37°Cのインキュベーター内で、60mmのペトリ皿の中央にアグロ溶液を大滴（約500µL）滴下します。微細ピンセットを用いて、形質転換胚から卵膜を除去します。取り出した胚を、エレクトロポレーションバッファーに0.02%のトリカイン麻酔薬を添加したペトリ皿に移し、2分間静置します。

次に、カットしたマイクロピペットチップを用いて、麻酔状態にある胚を6〜8個、準備したアガロースの液滴に転移させます。すべての胚が同じ方向を向き、垂直に一列に並ぶように配置してください。2〜3 mmの氷を入れた大きなシャーレを用いてアガロースを凝固させ、胚をその位置に固定します。

ディッシュにエレクトロポレーションバッファーとtricaを充填し、凝固したarosドロップが完全に溶液に浸っていることを確認します。注入用にフェノールレッド染料を加えた精製GFP発現プラスミドを準備します。次に、マイクロローダーピペットチップを用いてマイクロインジェクションピペットを作製します。

1〜2 µLのDNAプラスミド溶液を注入用ピペットに加え、充填済みピペットを圧力注入システムのピペットホルダーに装着して固定します。ピペットの先端を、発達中の脳の前端に向けた状態で、浸したキムワイプに素早く差し込み、圧力パルスによって赤色のDNA溶液が放出されるまでバックブレイクを行います。圧力注入法を用いて、発達中の脳の脳室にプラスミドDNA溶液を注入します。

DNAを将来の嗅球に隣接する位置まで押し込みます。前脳室の前端に赤色色素がはっきりと見えるまでDNAを注入してください。DNAの拡散と希釈を防ぐため、直ちにエレクトロポレーションのステップに進んでください。

SD nine刺激装置を、70 Vで5 msの単一電極穿孔パルスを発生させるように設定します。正極を胚の内端に隣接させ、負極を胚の頭部の後方に配置するように電極を設置します。

SD nine スチミュレーターの単一モードスイッチを使用して、8回の電気穿孔パルスを手動で開始させます。各パルスの間隔は1秒としてください。その後、胚を10分以上回復させます。

次に、微細ピンセットを使用して、胚自体に直接触れないように注意しながら、胚の外形をそっとなぞります。その後、胚をアガロースから取り出します。胚を胚用水に戻し、GFP発現の解析まで28 degrees Celsiusで保存します。

以前と同様に、胚を0.02% trica麻酔剤を含む卵水に数分間移しますが、今回はより小さい35 mmのペトリ皿の中心で行います。ここに、0.5%の低融点アガロース溶液とtricaを含む卵水を大きく1滴加えます。次に、カットしたマイクロローダーピペットチップを用いて、麻酔した胚を1つこのアガロースの滴に加えます。

正立顕微鏡下で、発達中の脳を背面から観察しやすいように、胚を直立させます。アロースを氷上で凝固させ、切断したマイクロローダーチップを用いて胚の向きを固定します。最後に、凝固したアロースのドロップが完全に浸るように、Tricaを加えた卵水をディッシュに満たします。

この例では、in vivo エレクトロポレーションの時間的分解能と、エンハンサートラップ導入系統による細胞型特異的な発現を組み合わせ、発達中の嗅球を標的にしています。この導入エンハンサートラップ系統は、受精後5日の胚において、後脳、小脳、前脳、および嗅球で m cherry と calt A four を構成的に発現します。重要な点として、エレクトロポレーションの4日後、GFP発現細胞は嗅球僧帽細胞に典型的な軸索投射を示します。

M Cherryのシグナルと、露光時間を短くしたGFPのシグナルを比較することで、shRNAコンストラクトを用いた際に、GFPを発現する細胞体が実際に嗅球に局在していることが示されました。この手順は、発達中の脳における特定の細胞タイプで機能喪失を誘導するためにも利用可能です。