外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

本手順の総合的な目的は、電気運動性、緩徐運動性、および音響周波数における屈曲を含む、外有毛細胞（OHC）の運動応答を調査するための信頼性の高い手法を導入することです。これは、まずモルモット、マウス、またはその他の哺乳類から側頭骨を採取し、鼓室を切り開いて蝸牛を露出させることで達成されます。次のステップでは、蝸牛をLebovits L 15に浸し、骨格の外殻の頂端部、螺旋靭帯、およびstria vascularisを除去し、コルチ器を取り出します。

コルチ器を1 mg/mLのコラゲナーゼ中で5分間インキュベートした後、50 µLのハミルトンシリンジを用いて記録室に移動させ、針で還流させることで細胞を分散させます。その後、記録室を顕微鏡に移動し、外部交流電界による細胞刺激を行い、単離した外有毛細胞の運動反応を高速度カメラでビデオ録画します。最終的に、コンピュータ支援画像解析によって、外有毛細胞の電気運動性、緩徐運動性、および音響周波数での屈曲を評価することができます。

モルモット、マウス、またはその他の哺乳類動物モデルから側頭骨を採取して、本手順を開始します。次に、ニッパーを用いて側頭骨を開きます。蝸牛を露出させるために、蝸牛の骨殻を損なわないよう注意しながら余分な骨を除去し、L-15溶液に浸します。

顕微鏡下で、蝸牛の頂端部を開きます。メス刃の先端、マイクロポイントピック、または微細ピンセットを用いて、ドライヤー、VASIs、および螺旋靭帯を除去します。ピンセットを用いて、蝸牛管からコルチ器を取り出します。

次に、蝸牛を1 mg/mLのコラゲナーゼ溶液に入れ、室温で5分間置きます。蝸牛の基底回転から有毛細胞を回収する必要がある場合は、ピックを用いて蝸牛基底部を覆う骨殻を除去し、メスを用いて蝸牛管を側頭骨から分離します。コルチ器を回収する前に、50 µLのハミルトンシリンジを用いてコルチ器を記録室へ移します。その後、針を通して細胞を還流させることで細胞を分散させます。

外部交流電場発生装置と、House Ear Instituteのエンジニアリングコアで特別に実装された画像キャプチャシステム、制御回路、およびソフトウェアとの連携を示す図がこちらです。本実験で使用した実験セットアップは、LEDベースの代替照明システムと2台の電子マイクロマニピュレーターを備えたAxia vert 1 3 5 TV倒立顕微鏡で構成されています。顕微鏡には3つのカメラレポートがあり、テレポートにはPC制御の超高速フォトロン、fast cam X 10 24 PCIカメラが搭載されており、高解像度で最大100,000 FPSの高周波画像キャプチャが可能です。

高速カメラから提供される画像は、PCモニターで直接観察されます。接眼ポートにある別の通常のCCDカメラは、高解像度モニターに接続されています。フロントポートにある従来のデジタルフォトカメラにより、静止フレームのキャプチャが可能です。同じPCで動作する自作ソフトウェアが、高速カメラ、照明システム、および外部交流電場マウントのトリガーを制御します。

電気マイクロマニピュレーター上に、先端間距離 0.8 millimeter の直径 0.25 millimeter の銀線 2 本で構成される 2 つの電極を配置します。次に、外部電極を用いて電界をキャリブレーションします。この電極で異なる地点の電位を測定し、電界マップを作成します。

単一の単離された外有毛細胞を、その長軸が印加される交流電界と平行になるように電極の先端間に配置すると、細胞は電界と同じ周波数で伸長と短縮を繰り返して動作します。例えば、ここでは50 hertzで刺激され、1000 frames per secondで記録された細胞を示しています。次の画像は、4 kilohertzで刺激され、18, 000 frames per secondで記録された細胞を示しています。

細胞を電場に対して垂直に配置すると、異なるタイプの外有毛細胞の屈曲反応を観察し、調査することができます。例えば、この細胞は、長軸に対して垂直な電場で50 hertzの刺激を与えると屈曲します。外有毛細胞は、非電気的な刺激に応答して形状を変化させることがあります。

この反応は緩徐運動と呼ばれ、本手法を用いて検討することが可能です。4つの異なるプロトコルの中から異なる刺激を選択してください。1つ目は、単一周波数の連続刺激です。

刺激モード、周波数、振幅、および波形を選択可能であり、これらは自作の制御ソフトウェア上の赤色の円で示されています。2番目の刺激プロトコルはバースト単一周波数であり、バーストの長さおよびバースト間の間隔を調整できます。3番目のプロトコルはリニアスイープであり、開始周波数と終了周波数を調整できます。

4番目の刺激プロトコルはマルチ刺激であり、異なる刺激モードの組み合わせが可能です。対応するパラメータを選択すると、制御ソフトウェアがシステムを構成し、オペレーターはコンピュータ画面上のボタンを1回クリックするだけで、光同期ビデオ録画と細胞刺激を同時に開始できます。本動画では、単離した外有毛細胞に、その長軸に対してそれぞれ平行または垂直な外部交流電場による刺激を与えた際の、長さや曲率の変化を示しています。

外有毛細胞の応答は、Pro Analystsソフトウェアのフィーチャートラッキング機能を用いてオフラインで解析します。ここでは、50 Hzの周波数で刺激し、1秒間に1000フレームで記録した外有毛細胞を示しています。ソフトウェアは、細胞の短縮時に示されているように、2点間の距離をフレームごとに算出します。赤色で示されたクチクラプレート（cuticular plate）である頂端部と、緑色で示された基底極（basal pole）である細胞基底部で選択された点との間の距離は、細胞短縮時に小さくなり、細胞伸長に伴って増大します。このように、ソフトウェアは外有毛細胞の長さの変化をフレームごとに解析します。

画像下部のパネルは、移動のトレースを示しています。この例では、全変化量は約 6.5 pixels です。ここでは、pro analys ソフトウェアの輪郭追跡機能により、細胞端を検出し、光学切片の面積を自動的に測定できることを示す例を提示します。

本実験では、ポリスチレン微小球をバス溶液中にランダムに添加し、細胞膜に強固に付着させます。異なる微小球を同時に選択でき、ソフトウェアによってそれらすべてをフレームごとに自動的に追跡することが可能です。これにより、細胞を複数のセクションに分割し、各セクションの運動性を独立して評価することができます。

細胞の側縁に位置するマイクロスフィアを選択することで、各セグメントの長さの変化および、一方のセグメントに対するもう一方のセグメントの角度の変化を独立して評価することが可能です。この手法に習熟し、適切に実施すれば、3時間で完了させることができます。

もちろん、記録された動画をオフラインで解析するには、さらに時間が必要です。しかし、適切なソフトウェアを使用すれば、この解析は1本の動画につき概ねあと3時間程度で完了できます。このビデオを視聴することで、電気運動性、緩慢運動性、および音響周波数における屈曲を含む、外有毛細胞の運動応答を調査する方法について十分に理解できたはずです。