Name: 外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ外有毛細胞の運動性調査法。モルモットやマウスの側頭骨から蝸牛を採取し、コラゲナーゼ処理で細胞を分離後、外部交互電場刺激と高速画像解析で電気運動性や屈曲を評価します。聴覚メカニズムの解明に貢献します。

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P30 DC006276リサーチコア、およびHEIをNIDCD、健康補助R01DC10146/R01DC010397の国立研究所によってサポートされる作業。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHや高等教育機関の公式見解を示すものではありません。著者らは関心のない既存のまたは潜在的な競合を宣言しません。

1。 OHCSの分離<ol><li>モルモット、マウスまたはあなたの哺乳動物のモデルから、側頭骨を採取して、この手順を開始する。 </li><li>次に、蝸牛を露出させるために槌ニッパーを使用して側頭骨を開き、リーボビッツL - 15でそれらを浸す。骨のシェルを保ったまま、慎重に骨の過剰を削除します。これは任意の哺乳動物種の頭骨に適用される一般的な手続きであるのに対し、非常に小さな動物から頭骨を扱うときに、テクニックに若干の変更が必要になる場合があります。古い動物では水疱は、通常の手順に追加の合併症を導入し、石灰化しています。 </li><li>顕微鏡観察下では、＃11手術用メスの刃、マイクロポイントのピックと細かいピンセットの先端を使用して蝸牛と削除血管条とスパイラル靭帯の先端領域を開きます。 </li><li>ピンセットを使って人工内耳蝸牛のコルチ器官を脱いで、そして5分間、室温でL - 15で1mg/mlコラゲナーゼでそれを置く。 </li><li>蝸牛の基底回転からOHCSが必要な場合は、ピックと蝸牛の基部をカバーする骨のシェルを削除し、コルチ器官を削除する前に、手術用メスの刃を使用して、側頭骨からスパイラルを分離。 </li><li> 50μLハミルトンシリンジを使用して録音室にコルチ器官を転送する。その後、針を通して逆流して細胞を解離する。 </li></ol> 2。実験的なセットアップ<ol><li>外部交互電界（EAEF）ジェネレータと画像キャプチャシステム（図1）とのリンクの図。制御回路は、特別にハウス耳研究所のエンジニアリングのコアで実装されました。 </li><li>本実験で用いた実験では、代替のLEDベースの照明システムとAxiovert 135TV倒立顕微鏡（Zeiss、ソーンウッド、ニューヨーク州）で構成されています（ハイパワーLEDはシステム36AD3500、ライトスピードテクノロジーズ、キャンベル、カリフォルニア州）、二つの電子マニピュレーター（エッペンドルフ"Patchman"、ドイツ）、ケラーポートと三眼鏡ポートの追加の通常のCCDカメラでパソコン制御の超高速フォトロンFASTCAM X 1024 PCIカメラ（フォトロン米国株式会社）。 FASTCAMのカメラは、高い周波数（100,000 fpsまで）と高解像度（例えば、これは1,000 fpsの、10,000 fpsで512 × 128、18000 fpsで384 × 96、および1024 × 1024ピクセル）で画像をキャプチャすることができます。 CCDカメラが別のモニタに接続されているのに対し、ハイスピー​​ドカメラによって提供された画像は、直接、PCモニタで観察される。アナログ低消費電力とハイパワーデジタル：LEDベースの照明システムは、2つの異なるモードで動作します。すべての準備作業（電極の位置、セルの位置、ピント、など）は、低消費電力アナログモードを使用して実行されます。ハイパワーの照明は、カメラのシャッターの開口部でオンにし、放熱を促進する、シャッターの開閉ではオフになっています。また、同じPC上で実行されている、ハウス耳研究所エンジニアリングのコアで開発された自家製のソフトウェアは、ハイスピー​​ドカメラ、LEDベースの照明システム、およびEAEFのトリガを制御します。必要に応じて前面のポートで、従来のデジタル写真のカメラは、静止フレームが可能になります。 （図2 A）。 </li><li>電極（0.8 mmの先端の距離が二つ0.25ミリメートル径のAg線）は、電子マイクロマニピュレータのいずれかを使用して位置に駆動されています。電極の位置を視覚的および顕微鏡画像を通じて監視され、イメージの焦点面での変化は、電極が、実験室の底に触れたことを示しています。当初は、電界が外部電極を用いて校正されています。この電極は、電界の"マップ"を生成し、異なる点の電位を測定します。単一の孤立した外有毛細胞が適用EAEFにその長手方向軸に平行に電極の先端の間に配置されている場合、それは伸長し、電界の同じ周波数で短縮移動します。セルがフィールドに垂直に配置されている場合OHC応答（曲げ）の異なるタイプが観察して調べることができる。 （図2 B） </li></ol> 3。 EAEFの刺激と画像キャプチャ<ol><li>つの異なる刺激プロトコルが（図3）選択可能です。 <ol><li>連続的な単一周波数（図3 A）。刺激モード、周波数、振幅、波型は自家製制御ソフトウェア（赤い丸）を使用して選択できることに注意してください。 </li><li>バースト単一周波数（図3 B）。バーストの間にバーストとギャップの長さも選択可能です。 </li><li>リニア掃引（図3 C）。最初と最後の選択可能な周波数は。 </li><li>マルチ刺激（図3 D）。単一の周波数とリニア掃引は、単一の実験で組み合わせることができます。対応するパラメータを選択した後、制御ソフトウェアは、システムを設定し、オペレータは、単一のボタンをクリックすることで光同期した映像を録画し、細胞の刺激を開始することができますコンピュータの画面。 </li></ol></li><li>画像は、高周波でのさらなる分析のためのAVI形式でキャプチャされます。 </li></ol> 4。代表的な結果<ol><li>この映画では、2つの絶縁外有毛細胞は、それらが彼らの縦軸に、それぞれ、平行または横である外部交互に電界で刺激されている長さや曲率の変化を示す。 （ムービー＃2）。 </li><li> OHCS運動性応答はProAnalystソフトウェア（Xcitex社、ケンブリッジ、MA）を使用してオフラインで分析されます。このソフトウェアの"機能のトラッキング"機能は、2つのポイントフレームごとに（図4）の間の距離を提供します。とセル（基礎柱、緑の色）のベース、頂点（赤い色クチクラプレート）で選択したポイント間の距離を短くするセルの間に小さく、細胞の伸長とともに増加。映画の長さは、フレームごとの変化を分析するソフトウェアを示しています。画像の下部にあるパネルには動きのトレースを示します。この例では、長さの変化量は6.5画素程度です。 </li><li> ProAnalystソフトで"輪郭トラッキング"機能は、セルのエッジを検出し、自動的に光学部（図5）の面積を測定することができます。 </li><li>ポリスチレン微小球は、ランダムにお風呂の溶液に添加し、しっかりと形質膜（図6）に取り付けます。別のミクロスフェアを同時に選択することができ、ソフトウェアは自動的にこれらのすべてのフレーム単位で追跡することができます。このように、細胞はセクションに分かれ、各セクションの運動性は、独立して評価することができます。 （図6 A） </li><li>選択して、微小球は、細胞画像の横方向の端に位置し、各セグメントの長さの変化と1つのセグメントの点の角度の変化は、（曲げ）他にも独立して評価することができます。 （図6B） </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。EAEFジェネレータと画像キャプチャシステムとのリンクの図。 <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 実験装置の図2）の画像。顕微鏡ステージのB）の詳細、漫画は、電極と電界と平行に長手方向の軸とそれらの間に配置された単一のOHCを描いたと。 <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。単周波数刺激用に設定された自家製の制御ソフトウェアの）ユーザインタフェース。選択されたパラメータは、赤色の丸で囲まれている。 B）自家製制御ソフトウェアのユーザインターフェースは、バースト単一周波数の刺激のために設定。 C）リニアスイープの刺激のために設定されたホームメイドの制御ソフトウェアのユーザーインターフェースは。マルチ刺激用に設定された自家製の制御ソフトウェアのD）のユーザインタフェース。 <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。細胞の単ベースで設定した二つの点とOHCのフレーム（緑）と頂点（赤）、それぞれ、ProAnalystソフトウェアの"機能の追跡"機能を使用する。セルの下の曲線は電気刺激に関連付けられ、選択したポイント間の距離の周期的な変化を示しています。縦棒の異なるフレームを移動は、個々の分析のために選択することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図5"> 図5。ProAnalystで"輪郭トラッキング"機能は、セルのエッジを検出し、自動的に光学部の面積を測定する。 <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="図6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図6"> 図6。ポリスチレン微小球（上）、および5つの微小球と同じ画像を個別に（下）を選択した状態で飾ら孤立OHCの）撮影画像。異なる色は、それぞれのミクロスフェアに割り当てられていた、と彼らの変位は、個別に、自動的にフレームごとに追跡することができる、分析と比較した。 B）任意の長さのセグメントがポリスチレン微小球は、細胞の端に位置し、及びこれらのセグメントの長さの変化だけでなく、他の人への1つのセグメントの点（セルが曲げ）の向きの変更が自動的にでフレームを評価することができますを選択することによって定義することができます。画像解析ソフトウェアとのフレーム。 モルモットのOHCSの動画1。分離。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">ビデオを見るためにここをクリック</a> 映画は2。典型的なelectromotilityと曲げ応答を示すEAEFにOHCSの平行と垂直に。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">ビデオを見るにはここをクリック</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
<li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin%2C+a+new+type+of+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+cochlear+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li>
<li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li>
<li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+outer+hair+cell+motility%3A+corrections+and+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li>
<li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここに示した実験方法は、細胞の動きに何ら制限なくkHzの範囲でOHC運動性応答を推定することができます。異なる刺激プロトコル、追加のマーカー（ミクロスフェア）は、電界に対するセルの向きにも変化として、それは可能な限り以前にアクセスできない細部のレベルでOHCの運動の新たな側面を調査すること。他の方法は、例えば、フォトダイオード9またはレーザドップラ振動計10を使用して 、それらは、細胞の位置の厳密な制御を必要とする。ここでは、対照的に、すべての測定は、同じセルに属する点の間で実行され、すべての変位が唯一の細胞の形状ではなく、参照の外部フレームに関連したそれらの動きと変化に関連付けられています。断面OHCの領域の信頼性の測定も容易にOHCの体積の急激な変化の推定を可能になる、得られる。加えて、より速く、より高感度カメラと優れた画像解析ソフトウェアの継続的な開発は、方法の質の継続的な改善を保証する。技術の欠点、原形質膜間の電位で制御なしには、kHzの範囲のOHCの運動性を評価するために使用されるすべての現在の方法で共有する制限です。 <p class="jove_co...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>リーボビッツのL - 15 </td><td>ギブコ</td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ（タイプ4） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C5138 </td><td> L - 15で1mg/mL </td></tr></tbody></table>

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHCSはコルチ器、哺乳類の内耳内の聴覚器官のオルガンにある円筒状の感覚細胞である。名前&quot;有毛細胞&quot;は不動の彼らの特徴的な心尖部のバンドル、音のエネルギー1の検出と伝達に重要な要素に由来する。 OHCSは、電気的、機械的および化学的刺激、音響信号の内耳増幅2のための非常に重要な運動応答への応答に曲げ、形状、伸長、短縮して変更することができます。 ⅰ）electromotility、別名速い運動性、密にOHC細胞膜にパックされたモーター蛋白質の電気駆動型コンフォメーション変化から派生したマイクロ秒の範囲の長さの変化、およびii）ゆっくりと運動性、の形状変化：OHCの刺激は、2つの異なる運動性応答を誘導秒のミリ秒は、細胞骨格再構築2、3を含む範囲です。 OHC曲げはelectromotility、そしてどちら側細胞膜、またはこれらのモータータンパク質の非対称な電気刺激（例えば、細胞の長軸に電界の垂直付き）4のモータータンパク質の非対称分布の結果に関連付けられています。機械的および化学的刺激は、細胞のイオンの状況の変化及び/またはそれらの環境にも細胞膜に埋め込 ​​まれたモーター蛋白質5、6を刺激することができるにもかかわらず、本質的に遅い運動性応答を誘導する。 OHC運動性応答は蝸牛増幅器の不可欠な要素、音響周波数（およそ人間の20 Hzから20 kHzから）で、これらの運動性応答の定性的および定量的な分析であるため、研究7聴覚の分野において非常に重要な問題です。 ハイスピー​​ドビデオカメラ、LEDベースの照明システム、および高度な画像解析ソフトウェアを組み合わせた新たなイメージング技術の開発は外部の交流電界（EAEF）に信頼性の高い定性および孤立OHCSの運動性応答の定量的研究を実行する機能を提供します。 8。これは、前のアプローチ9-11限界のほとんどを回避する有効な手段シンプルかつ非侵襲的方法である。また、LEDベースの照明システムは、サンプルのわずかの熱影響で極端な明るさを提供し、ビデオ顕微鏡の使用により、光学解像度は、従来の光顕微鏡技術12と比べて少なくとも10倍高いですので。例えば、実験的なセットアップはここで説明すると、約20nmのセルの長さの変化は、日常的かつ確実に10 kHzの周波数で検出することができ、そしてこの決議は、さらに低い周波数で改善することができます。 我々はこの実験的なアプローチはOHCの運動の基礎となる細胞および分子メカニズムの理解を広げるのに役立つと確信しています。

electromotility、遅い運動性と曲げを含む外有毛細胞（OHC）運動性応答を、調査するために信頼性の高い方法が記載されている。 OHCの運動性は、外部の交流電界と刺激によって誘発される、との方法は、高速画像記録、LEDベースの照明、そして最後の世代の画像解析ソフトウェアを活用しています。

外有毛細胞（OHC）は、哺乳類の内耳にある聴覚器官であるコルチ器に位置する円筒形の感覚運動細胞である。「有毛細胞」という名称は……

本手順の総合的な目的は、電気運動性、緩徐運動性、および音響周波数における屈曲を含む、外有毛細胞（OHC）の運動応答を調査するための信頼性の高い手法を導入することです。これは、まずモルモット、マウス、またはその他の哺乳類から側頭骨を採取し、鼓室を切り開いて蝸牛を露出させることで達成されます。次のステップでは、蝸牛をLebovits L 15に浸し、骨格の外殻の頂端部、螺旋靭帯、およびstria vascularisを除去し、コルチ器を取り出します。コルチ器を1 mg/mLのコラゲナーゼ中で5分間インキュベートした後、50 µLのハミルトンシリンジを用いて記録室に移動させ、針で還流させることで細胞を分散させます。その後、記録室を顕微鏡に移動し、外部交流電界による細胞刺激を行い、単離した外有毛細胞の運動反応を高速度カメラでビデオ録画します。最終的に、コンピュータ支援画像解析によって、外有毛細胞の電気運動性、緩徐運動性、および音響周波数での屈曲を評価することができます。モルモット、マウス、またはその他の哺乳類動物モデルから側頭骨を採取して、本手順を開始します。次に、ニッパーを用いて側頭骨を開きます。蝸牛を露出させるために、蝸牛の骨殻を損なわないよう注意しながら余分な骨を除去し、L-15溶液に浸します。顕微鏡下で、蝸牛の頂端部を開きます。メス刃の先端、マイクロポイントピック、または微細ピンセットを用いて、ドライヤー、VASIs、および螺旋靭帯を除去します。ピンセットを用いて、蝸牛管からコルチ器を取り出します。次に、蝸牛を1 mg/mLのコラゲナーゼ溶液に入れ、室温で5分間置きます。蝸牛の基底回転から有毛細胞を回収する必要がある場合は、ピックを用いて蝸牛基底部を覆う骨殻を除去し、メスを用いて蝸牛管を側頭骨から分離します。コルチ器を回収する前に、50 µLのハミルトンシリンジを用いてコルチ器を記録室へ移します。その後、針を通して細胞を還流させることで細胞を分散させます。外部交流電場発生装置と、House Ear Instituteのエンジニアリングコアで特別に実装された画像キャプチャシステム、制御回路、およびソフトウェアとの連携を示す図がこちらです。本実験で使用した実験セットアップは、LEDベースの代替照明システムと2台の電子マイクロマニピュレーターを備えたAxia vert 1 3 5 TV倒立顕微鏡で構成されています。顕微鏡には3つのカメラレポートがあり、テレポートにはPC制御の超高速フォトロン、fast cam X 10 24 PCIカメラが搭載されており、高解像度で最大100,000 FPSの高周波画像キャプチャが可能です。高速カメラから提供される画像は、PCモニターで直接観察されます。接眼ポートにある別の通常のCCDカメラは、高解像度モニターに接続されています。フロントポートにある従来のデジタルフォトカメラにより、静止フレームのキャプチャが可能です。同じPCで動作する自作ソフトウェアが、高速カメラ、照明システム、および外部交流電場マウントのトリガーを制御します。電気マイクロマニピュレーター上に、先端間距離 0.8 millimeter の直径 0.25 millimeter の銀線 2 本で構成される 2 つの電極を配置します。次に、外部電極を用いて電界をキャリブレーションします。この電極で異なる地点の電位を測定し、電界マップを作成します。単一の単離された外有毛細胞を、その長軸が印加される交流電界と平行になるように電極の先端間に配置すると、細胞は電界と同じ周波数で伸長と短縮を繰り返して動作します。例えば、ここでは50 hertzで刺激され、1000 frames per secondで記録された細胞を示しています。次の画像は、4 kilohertzで刺激され、18, 000 frames per secondで記録された細胞を示しています。細胞を電場に対して垂直に配置すると、異なるタイプの外有毛細胞の屈曲反応を観察し、調査することができます。例えば、この細胞は、長軸に対して垂直な電場で50 hertzの刺激を与えると屈曲します。外有毛細胞は、非電気的な刺激に応答して形状を変化させることがあります。この反応は緩徐運動と呼ばれ、本手法を用いて検討することが可能です。4つの異なるプロトコルの中から異なる刺激を選択してください。1つ目は、単一周波数の連続刺激です。刺激モード、周波数、振幅、および波形を選択可能であり、これらは自作の制御ソフトウェア上の赤色の円で示されています。2番目の刺激プロトコルはバースト単一周波数であり、バーストの長さおよびバースト間の間隔を調整できます。3番目のプロトコルはリニアスイープであり、開始周波数と終了周波数を調整できます。4番目の刺激プロトコルはマルチ刺激であり、異なる刺激モードの組み合わせが可能です。対応するパラメータを選択すると、制御ソフトウェアがシステムを構成し、オペレーターはコンピュータ画面上のボタンを1回クリックするだけで、光同期ビデオ録画と細胞刺激を同時に開始できます。本動画では、単離した外有毛細胞に、その長軸に対してそれぞれ平行または垂直な外部交流電場による刺激を与えた際の、長さや曲率の変化を示しています。外有毛細胞の応答は、Pro Analystsソフトウェアのフィーチャートラッキング機能を用いてオフラインで解析します。ここでは、50 Hzの周波数で刺激し、1秒間に1000フレームで記録した外有毛細胞を示しています。ソフトウェアは、細胞の短縮時に示されているように、2点間の距離をフレームごとに算出します。赤色で示されたクチクラプレート（cuticular plate）である頂端部と、緑色で示された基底極（basal pole）である細胞基底部で選択された点との間の距離は、細胞短縮時に小さくなり、細胞伸長に伴って増大します。このように、ソフトウェアは外有毛細胞の長さの変化をフレームごとに解析します。画像下部のパネルは、移動のトレースを示しています。この例では、全変化量は約 6.5 pixels です。ここでは、pro analys ソフトウェアの輪郭追跡機能により、細胞端を検出し、光学切片の面積を自動的に測定できることを示す例を提示します。本実験では、ポリスチレン微小球をバス溶液中にランダムに添加し、細胞膜に強固に付着させます。異なる微小球を同時に選択でき、ソフトウェアによってそれらすべてをフレームごとに自動的に追跡することが可能です。これにより、細胞を複数のセクションに分割し、各セクションの運動性を独立して評価することができます。細胞の側縁に位置するマイクロスフィアを選択することで、各セグメントの長さの変化および、一方のセグメントに対するもう一方のセグメントの角度の変化を独立して評価することが可能です。この手法に習熟し、適切に実施すれば、3時間で完了させることができます。もちろん、記録された動画をオフラインで解析するには、さらに時間が必要です。しかし、適切なソフトウェアを使用すれば、この解析は1本の動画につき概ねあと3時間程度で完了できます。このビデオを視聴することで、電気運動性、緩慢運動性、および音響周波数における屈曲を含む、外有毛細胞の運動応答を調査する方法について十分に理解できたはずです。

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聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

ここでは、ホッピングプローブイオン伝導顕微鏡(HPICM)、ライブ聴覚ヘアセルの立体束のナノスケールイメージングを可能にする非接触スキャンプローブ技術のプロトコルを提示します。...

生きた哺乳類聴覚毛細胞におけるナノスケール分解能によるステレオシリアバンドルイメージング

学ぶ外有毛細胞の運動性調査法。モルモットやマウスの側頭骨から蝸牛を採取し、コラゲナーゼ処理で細胞を分離後、外部交互電場刺激と高速画像解析で電気運動性や屈曲を評価します。聴覚メカニズムの解明に貢献します。

外部交互電場刺激と高速画像解析の組み合わせで外有毛細胞の運動性の調査

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