Name: ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: 学ぶヒト胚性幹細胞から肝細胞様細胞への分化誘導法。約90%の効率で機能的なhepatocyteを生成し、薬物毒性予測や肝臓研究に応用可能な技術です。

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博士ヘイは博士西、RCUKフェローシップによってサポートされていました外科でサポートされていた、博士MedineはBHFコア基金からの助成金によって支えられて、氏バルタザルLucendo - VillarinはMRC博士Studenshipによってサポートされていました。博士周は、中国政府からの奨学金によって支えられている。

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

私たちは、人間のHLCsのスケーラブルなレベルを生成するために、単純な均質およびin vitroで再現性の高いモデルを開発した。我々のモデルは、外部の協力研究室の数によって検証されています。我々は日常的に発達マーカーと肝特異的機能アッセイ（これのほとんどが市販されている）の私達の家のツールボックスを使用して幹細胞由来のHLCsを特徴付ける。私たちのプロセスの重要な段階があります：多能性幹細胞の維持、内胚葉への幹細胞の分化を誘導する機能、肝内胚葉およびin vitroでの広い範囲の機能を示す成熟した肝内胚葉を導出する能力の均質な文化の仕様。 HLC技術を由来幹細胞の大規模展開への一つの制限は、文化の成熟した肝内胚葉（マトリゲル上〜4日）の短期差別化機能となっています。このように我々は、ポリマーをスクリーニングしているバイオアクティブと小説携帯電話をサポートするためのライブラリ。これは、少なくとも15日間肝機能を維持する新規担体の同​​定につながっている。この技術の今後の方向性は、最初に創薬プロセスの工業アプリケーション（ヘイら2011年）です。中...

マトリゲルコーティングプレートとフラスコ<ol><li>マトリゲル（10 mLを、BD Biosciences社、英国）、-20℃で保存</li><li> KO - DMEM（500mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、4℃で保存します。 </li><li>組織培養プレート（ウェル6、ウェル12、コーニング、英国） </li><li>組織培養フラスコ（ベント25平方センチメートル、コーニング、英国） </li></ol> hESCのメンテナンス<ol><li>マウス胚性線維芽細胞条件培地（MEF - CM）（100mLの、R＆Dシステムズ社、米国）、-20℃で保存します。 </li><li> BSA溶液（50mL、シグマアルドリッチ、英国）、4℃で保存します。 </li><li>人間の塩基性線維芽細胞増殖因子（100μgを、Peprotech社製、米国）、-20℃で保存</li></ol>コラゲナーゼで継代ヒトES細胞<ol><li>ヒトES細胞のコンフルエントよくまたはフラスコ。 </li><li>必要に応じて、マトリゲル被覆ウェルまたはフラスコ。 </li><li> Phospate緩衝生理食塩水（- MgCl 2の 、 -のCaCl 2）（500mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、室温で保管。 </li><li>コラゲナーゼIV（1グラム、ギブコ、Invitrogen、英国）、4℃で保存します。 </li><li>マウス胚性線維芽細胞条件培地（MEF - CM）（100mLの、R＆Dシステムズ社、米国）。 </li><li>人間の塩基性線維芽細胞増殖因子（100μgを、Peprotech社製、米国）。 </li></ol>肝内胚葉へのヒトESの分化<ol><li> RPMI 1640（500 mLを、ギブコ、Invitrogen社、英国）、4℃で保存します。 </li><li> B27サプリメント（10 mLを、ギブコ、Invitrogen社、英国）、-20℃で保存</li><li>アクチビンA（2μgを、Peprotech社製、米国）、-20℃で保存します。 </li><li>組換えマウスのWnt3a（2μgを、R＆Dシステムズ社、米国）、-20℃で保存</li><li> KO - DMEM（500mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、4℃で保存します。 </li><li> KO - SR（500mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、-20℃で保存</li><li>非必須アミノ酸（100mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、4℃で保存します。 </li><li> β-メルカプトエタノール（10 mLを、ギブコ、Invitrogen社、英国）、4℃で保存します。 </li><li> DMSO（シグマアルドリッチ、英国）、室温で保管</li><li>リーボビッツL - 15培地（500mLの、SIGMアルドリッチ、英国）、4℃で保存します。 </li><li>トリプトースリン酸塩ブロス（100mLの、シグマアルドリッチ、英国）、4℃で保存します。 </li><li>胎児ウシ血清、不活化熱（500mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、-20℃で保存</li><li>ヒドロコルチゾン21 -ヘミサクシネート（100mgを、シグマアルドリッチ、英国）、-20℃で保存</li><li>インスリン（ウシ膵臓）（100 mgの、シグマアルドリッチ、英国）、-20℃で保存</li><li> L -グルタミン（100mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、-20℃で保存</li><li>アスコルビン酸（25グラム、シグマアルドリッチ、英国）、-20℃で保存します。 </li><li>ヒトHGF（10μgを、Peprotech社製、米国）、-20℃で保存</li><li>組換えヒトオンコスタチンM（OSM）（50μgの、R＆Dシステムズ社、米国）、-20℃で保存します。 </li><li>シリンジは、フィルタユニット0.22μmの（ミリポア、英国）を駆動</li></ol>ヒトES細胞由来の肝内胚葉のキャラクタリゼーション免疫染色<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（- MgCl 2の 、 -のCaCl 2）（500mLの、ギブコ、Invitrogen社、英国）、STO室温で再。 </li><li> PBST、PBS、0.1％Tween 20（Sigma - Aldrich社、英国）で構成さ。 </li><li>パラホルムアルデヒド（PFA）（Sigma - Aldrich社、英国）をPBSで構成され、店舗-20℃ </li><li>グリセロール（Sigma - Aldrich社、英国）、室温で保管。 </li><li>トリスベース（Sigma - Aldrich社、英国）、室温で保管。 </li><li>エタノール</li><li>血清（ABD Serotech、英国）、-20℃で保存</li><li>二次抗体、Alexaのフルオロフォア（Molecular Probes社、Invitrogen社、英国）。 </li><li> MOWIOL 4から88は（Polysciences社、米国）あたりの製造業者の指示としてトリスHCLとグリセロールで構成されています。 DAPI（ピアース、サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）は、1:1000希釈でMOWIOL溶液に添加される。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">一次抗体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原* </td><td>タイプ</td><td>サプライヤー</td><td>希釈</td></tr><tr><td> ALB </td><td>モノクローナルマウス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 1月5日00 </td></tr><tr><td> E -カドヘリン</td><td>モノクローナルマウス</td><td>ミリポア</td><td> 100分の1 </td></tr><tr><td> α-フェトプロテイン</td><td>モノクローナルマウス</td><td>シグマ</td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td> SSEA - 4 FITC </td><td>モノクローナルマウス</td><td> Biolegend </td><td> 100分の1 </td></tr><tr><td> IgG抗体</td><td>モノクローナルマウス</td><td> DAKO </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td colspan="2">二次抗体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗マウスFITC共役</td><td>モノクローナルヤギ</td><td>インビトロジェン</td><td> 400分の1 </td></tr></tbody></table> 表2ヒトES細胞由来の肝内胚葉の免疫染色に用いる抗体を、使用される濃度は、種はで開発され、企業はそれらがから購入されています。 肝内胚葉とNormalisationの機能解析（mgタンパク質当たり） <ol><li> P4 - GLO CYP3A4、CYP1A2、キットおよびルミノメーター（Promega社製、米国）。 </li><li value="1">白色平底96ウェルアッセイプレート（BD Biosciences社、英国）。 </li><li> BCAアッセイキット（Pierce社、サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）。 </li><li>透明な96ウェルアッセイプレート（IWAKI、英国） </li></ol>

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

モデリング人間の薬物毒性の進歩にもかかわらず、多くの化合物は、予期せぬ副作用のために臨床試験中に失敗する。臨床試験の費用はかなりのもの、従ってそれはより多くの予測毒性学スクリーンを開発し、薬剤開発（Greenhoughら2010）で早い段階で展開されていることが不可欠です。ヒト肝細胞は、薬物の毒性を評価するための現在のゴールドスタンダードモデルを表していますが、変数機能を発揮する限られたリソースです。そのため、不死化細胞株や動物の組織モデルの使用が日常的に多量のために採用されている。両方のソースが有益であるが、彼らは貧しい機能、種の変動および/または培養における不安定性（ダルゲティら2009）によって制限されています。多能性幹細胞（PSCは）細胞などのヒト肝細胞の魅力的な代替ソース（HLCs）（Medineら2010）です。 PSCは自己再生し、成人で見つかったすべての体細胞型へ分化することが可能であり、それによって表しています分化した細胞の潜在的に無尽蔵の源。我々は、自動化と収量機能性ヒトHLCs（;フレッチャーら2008; Hannounら2010; Payne氏ら2011年とヘイら2011ヘイら2008）の影響を受けやすい、高効率、簡単な手続きを開発した。私たちは、私たちの技術が創薬、疾病のモデリング、体外装置の建設とおそらく細胞ベースの移植療法のためのHLCsのスケーラブルな生産につながると信じています。

この記事では、ヒト胚性幹細胞集団からヒト肝内胚葉の発生に焦点を当てます。

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

次の実験の全体的な目標は、in vitroでヒト肝臓の生物学を研究するために、均一なレベルのヒト肝細胞を生成することです。これは、AおよびWINTで活性な生理学的刺激を使用してヒト胚性幹細胞またはヒトESCを決定的内胚葉に駆動することによって開始され、第2ステップ A.As 決定的内胚葉は非常に効率的に肝臓内胚葉に駆動されます。次に、ヒトESC由来の肝内胚葉をin vitroで成熟させ、機能的なヒト肝細胞を作製します。PCRウェスタンブロッティング、免疫蛍光法、Eliza's、および薬物代謝の結果は、この方法が約90%の効率でヒトESCから肝細胞を誘導することを示していますこの技術により、理論的には、ヒト肝機能のかなりのレベルを示す初代ヒト肝細胞の無尽蔵の供給を生成することができます。将来的には、これは薬物毒性の正確な予測に役立ち、人間の肝臓をサポートします。秘訣は、太陽の分化とヒト細胞のコア密度を促進することです。コア細胞密度は均質な細胞集団を生成するために不可欠であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。私たちは、この技術を成功させるために、国際的に4つのサイトで15人以上の個人を訓練してきました。ヒト胚性幹細胞の培養から始め、マウス胚性線維芽細胞でコーティングされたマトリゲルコーティングプレート上で増殖します マウス胚性線維芽細胞 基本的なFGFを添加したORM cmで馴染ませます。肝臓の分化前に維持されているヒトESCを慎重に特徴付けることが重要です。例えば、これらの細胞はヒトESCの形態を示す。また、多能性幹細胞マーカーであるOCT 4およびnanoを、ポジティブコントロールのH sevenヒトESC株に匹敵するレベルで発現します。さらに、ヒトESCはSS EEA4に対して陽性です。ヒトのE ESCが30〜60%coの流暢さに達したら、ME CMを新しく調製した分化培地に交換します。肝臓の分化を開始するには、培地を24時間ごとに3日間交換する必要があります。.3日後、細胞は三角形の外観を帯び、内胚葉表現型に向かって分化し始めます。媒体をSR DMSOの微分に切り替えます。4〜5日間中培養します。メディアは48時間ごとに交換します。この5日間の期間の後、細胞は肝細胞に特徴的な多角形の外観を取り始めます。ヒトESCと肝内胚葉の分化は、9日目までに一連の重大な形態学的変化に反映されます。また、9日間のコースでオクタ4の発現は次第に減少していきます。対照的に、FPとアルブミンの肝臓転写産物は7日目以降に増加します。細胞を成熟させ、48時間ごとに新鮮な培地で9日間、最終培地で肝臓の表現型を維持することを続けます。最後に、とがった三角形の形状から多角形の外観を示す特徴的な肝臓の形態への段階的な形態学的変化について、位相コントラスト顕微鏡で培養細胞をモニターし、肝臓内胚葉機能アッセイを定量的に評価します。シトクロムP 4 50酵素活性、特にSIP3 A 4またはSIP 1 A 2の場合。最初のインキュベート17日目。ヒトESCは、特定の基質を持つ肝内胚葉細胞を誘導し、三重で反応を行います。組織培養培地をネガティブコントロールとして使用し、摂氏37度で5時間インキュベートすることを忘れないでください。上清を収集し、製造元の指示に詳述されているように、基礎酵素活性の相対レベルを測定します。次に、各サンプルについて、A-B-C-A-Sで決定されるタンパク質1ミリグラムあたりの酵素活性を計算します。この肝内胚葉のin vitro成熟法によって得られた典型的な培養物の免疫染色。3つのヒト肝臓マーカー、アルブミン、FPおよびeinの均一発現を示します。このビデオを見れば、ヒトを効率的に分化する方法と、幹細胞を肝細胞に学習する方法を十分に理解できるはずです。一度習得すると、この技術は100万個の細胞あたり約2分半のコミットメントで毎日行うことができます。分化の過程で、日常的に形態変化を確認することは非常に重要です。

robust-generation-hepatocyte-like-cells-from-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、ヒト肝細胞を由来幹細胞の長期、安定的な培養のためにポリマーコーティングされた表面の開発に注力していきます。...

最適化された合成表面を使用した肝細胞表現型の安定化

ここで紹介する方法は、多能性幹細胞からのヒト肝細胞様細胞を生成するための拡張性と優れた製造基準（GMP）-Readyビデオ分化システムを記載しています。これは、基礎および応用ヒト肝臓研究のためのヒト肝細胞様細胞を生成するために、費用対効果の高い標準化されたシステムとして機能します。...

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

ここで提示されたプロトコルでは、肝疾患の治療のための小さい分子を識別するためのプラットフォームについて説明します。ステップバイ ステップの説明は、96 ウェル プレートで肝細胞特性を持つ細胞に Ips...

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から肝細胞様細胞を18日間で効率的に生成する単層、血清フリー法を詳細に述べている。これは、hPSCが肝細胞様細胞を形成する前に、原始的な筋、決定的な内因性内因性、後部前腸および肝芽前駆体のような中間細胞型に順次分化するように6つのステップを伴う。...

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

このプロトコルは、定義された培養システムおよび細胞自己組織化を用いてヒト多能性幹細胞から肝球を産生するアプローチを記述する。このプロトコルは、多くの細胞株で再現可能であり、費用対効果が高く、生物医学的応用のための安定したヒト肝圏の生産を可能にする。...

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

本稿の目的は、多能性幹細胞からのヒト肝前駆物質分化を誘導する標準化されたアプローチを提供することです。すぐに使用できるメディア製剤を用いたこの手順の開発は、生物医学の研究と翻訳のためのヒト肝細胞を生成する容易なシステムをユーザーに提供する。...

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。...

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。...

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。...

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

利用可能な多能性幹細胞(PSC)から機能細胞への分化システムは、現在、深刻なライン間およびバッチ間のばらつきの問題によって妨げられています。ここでは、心臓の分化を主な例として、画像ベースの機械学習に基づいてPSCの分化プロセスをインテリジェントに監視および調整するためのプロトコルを紹介します。...

多能性幹細胞の分化を監視するための生細胞画像ベース機械学習戦略

学ぶヒト胚性幹細胞から肝細胞様細胞への分化誘導法。約90%の効率で機能的なhepatocyteを生成し、薬物毒性予測や肝臓研究に応用可能な技術です。

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

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