ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

次の実験の全体的な目標は、in vitroでヒト肝臓の生物学を研究するために、均一なレベルのヒト肝細胞を生成することです。これは、AおよびWINTで活性な生理学的刺激を使用してヒト胚性幹細胞またはヒトESCを決定的内胚葉に駆動することによって開始され、第2ステップ A.As 決定的内胚葉は非常に効率的に肝臓内胚葉に駆動されます。次に、ヒトESC由来の肝内胚葉をin vitroで成熟させ、機能的なヒト肝細胞を作製します。

PCRウェスタンブロッティング、免疫蛍光法、Eliza's、および薬物代謝の結果は、この方法が約90%の効率でヒトESCから肝細胞を誘導することを示していますこの技術により、理論的には、ヒト肝機能のかなりのレベルを示す初代ヒト肝細胞の無尽蔵の供給を生成することができます。将来的には、これは薬物毒性の正確な予測に役立ち、人間の肝臓をサポートします。秘訣は、太陽の分化とヒト細胞のコア密度を促進することです。

コア細胞密度は均質な細胞集団を生成するために不可欠であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。私たちは、この技術を成功させるために、国際的に4つのサイトで15人以上の個人を訓練してきました。ヒト胚性幹細胞の培養から始め、マウス胚性線維芽細胞でコーティングされたマトリゲルコーティングプレート上で増殖します マウス胚性線維芽細胞 基本的なFGFを添加したORM cmで馴染ませます。

肝臓の分化前に維持されているヒトESCを慎重に特徴付けることが重要です。例えば、これらの細胞はヒトESCの形態を示す。また、多能性幹細胞マーカーであるOCT 4およびnanoを、ポジティブコントロールのH sevenヒトESC株に匹敵するレベルで発現します。

さらに、ヒトESCはSS EEA4に対して陽性です。ヒトのE ESCが30〜60%coの流暢さに達したら、ME CMを新しく調製した分化培地に交換します。肝臓の分化を開始するには、培地を24時間ごとに3日間交換する必要があります。.

3日後、細胞は三角形の外観を帯び、内胚葉表現型に向かって分化し始めます。媒体をSR DMSOの微分に切り替えます。4〜5日間中培養します。

メディアは48時間ごとに交換します。この5日間の期間の後、細胞は肝細胞に特徴的な多角形の外観を取り始めます。ヒトESCと肝内胚葉の分化は、9日目までに一連の重大な形態学的変化に反映されます。

また、9日間のコースでオクタ4の発現は次第に減少していきます。対照的に、FPとアルブミンの肝臓転写産物は7日目以降に増加します。細胞を成熟させ、48時間ごとに新鮮な培地で9日間、最終培地で肝臓の表現型を維持することを続けます。

最後に、とがった三角形の形状から多角形の外観を示す特徴的な肝臓の形態への段階的な形態学的変化について、位相コントラスト顕微鏡で培養細胞をモニターし、肝臓内胚葉機能アッセイを定量的に評価します。シトクロムP 4 50酵素活性、特にSIP3 A 4またはSIP 1 A 2の場合。最初のインキュベート17日目。

ヒトESCは、特定の基質を持つ肝内胚葉細胞を誘導し、三重で反応を行います。組織培養培地をネガティブコントロールとして使用し、摂氏37度で5時間インキュベートすることを忘れないでください。上清を収集し、製造元の指示に詳述されているように、基礎酵素活性の相対レベルを測定します。

次に、各サンプルについて、A-B-C-A-Sで決定されるタンパク質1ミリグラムあたりの酵素活性を計算します。この肝内胚葉のin vitro成熟法によって得られた典型的な培養物の免疫染色。3つのヒト肝臓マーカー、アルブミン、FPおよびeinの均一発現を示します。

このビデオを見れば、ヒトを効率的に分化する方法と、幹細胞を肝細胞に学習する方法を十分に理解できるはずです。一度習得すると、この技術は100万個の細胞あたり約2分半のコミットメントで毎日行うことができます。分化の過程で、日常的に形態変化を確認することは非常に重要です。