腫瘍からのオルガノイドの調製:3D In Vitro腫瘍モデル

腫瘍組織を細かく刻みます。破片を消化バッファーの入ったチューブに移します。細胞を取り巻くコラーゲン線維が分解され、組織のマトリックスが劣化します。次に、消化された部分をペレット化し、消化バッファーのほとんどを廃棄します。チューブをフリックしてペレットを砕きます。

溶液

は現在、さまざまなサイズの細胞塊で構成されています。細胞の塊をトリプシンとROCK阻害剤の溶液に再懸濁します。トリプシンは腫瘍を分解し続け、阻害剤は細胞死を防ぎます。一定の間隔で、溶液をピペットで取り入れて塊を分解し、細胞を分散させます。次に、細胞を適切な濃度のマトリックス溶液に再懸濁しました。

培養プレートに溶液を滴下して、マトリックスドームを形成します。プレートを逆さまにインキュベーターに入れ、マトリックスを完全に固化させます。次に、細胞培養培地を加え、右側を上にしてインキュベートします。マトリックスは、オルガノイドの三次元成長をサポートする足場を提供します。

み

じん切りにした後、腫瘍片を15ミリリットルの消化バッファーチューブに入れ、摂氏37度で1.5〜2時間消化します。消化の最後に、遠心分離によって消化された組織を沈殿させ、上清を廃棄します。

チューブをフリックして細胞ペレットを緩めます。10マイクロモルのY-27632 ROCK阻害剤を添加した1ミリリットルの予熱トリプシンに細胞を再懸濁し、摂氏37度で5分間

。

インキュベーションの最後に、標準のP1000ピペットチップで組織スラリーを5回粉砕します。チューブをウォーターバスに戻し、さらに5分間のインキュベーションと粉砕を行います。

マトリックスドームプレーティングの場合、消化した細胞を9ミリリットルの冷媒体で洗浄し、遠心分離によって細胞を回収します。細胞を1ミリリットルの新鮮培地に再懸濁して計数し、計数後、もう一度遠心分離して細胞を回収します。腫瘍細胞を適切な量のマトリックスで希釈します。

200マイクロリットルのマトリックス細胞溶液を、摂氏55度に温めた6ウェルプレートの各ウェルに慎重に滴下します。ドームを室温で2分間固化させてから、プレートを逆さまにして摂氏37度のインキュベーターに20分間置きます。

ドームが完全に固まったら、アンドロゲンR1881とROCK阻害剤を添加した前立腺オルガノイド培地2ミリリットルを各ウェルに加えます。プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。