近位培養システム:細胞間のパラクリンシグナル伝達を研究するためのin vitro培養技術

パラクリンシグナル伝達では、細胞は隣接する細胞で応答を誘導するシグナル伝達分子を産生および分泌します。パラクリンシグナル伝達を模倣するには、まず卵巣がん細胞と中皮細胞の単一細胞懸濁液を適切な培地で調製します。

次に、無菌培養皿に逆多孔質膜インサートを取ります。がん細胞懸濁液をインサートメンブレンの底面にピペットして、液体ドームを形成します。細胞が落ち着き、膜に付着するようにインキュベートします。

インサートを反転させてメディアを排出します。インサートを増殖培地を含む新鮮な培養皿に移し、膜の底面に付着したがん細胞に栄養を与えます。次に、中皮細胞懸濁液をインサートウェルに加えます。細胞が膜の反対側に付着し、2つの細胞型間の直接接触を拒否するようにインキュベートします。

培養中、両方の細胞型がシグナル伝達因子を分泌します。これらの分子は、多孔質膜を通って隣接する細胞に向かって拡散します。それらは特定の細胞受容体に結合し、両方の細胞型で複雑なシグナル伝達カスケードを誘導します。

卵

巣がん細胞を1ミリリットルの0.25%トリプシンを含む80%コンフルエント混合物から40〜60秒間分離することから始め、続いて6ミリリットルの完全増殖培地で反応を中和します。遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを5ミリリットルの新鮮な完全増殖培地に再懸濁します。

計数後、細胞を完全増殖培地濃度1ミリリットルあたり100,000個の卵巣癌細胞に希釈し、実験条件ごとに3つの逆0.4マイクロメートルの細孔組織培養処理ポリカーボネート膜細胞培養インサートを適切なサイズの滅菌組織培養皿に入れます。実験条件に応じてインサートにラベルを付け、膜の中央から外側に移動して、同心円状に各インサートの底にがん細胞を慎重にピペッティングして、800マイクロリットルのドームを形成します。

イン

キュベーション中に培地を含む細胞のドームがインサートの端から流れ落ちないように、インサートの底面に細胞を播種するときは細心の注意を払ってください。

すべてのインサートが播種されたら、皿に蓋をし、インサートを細胞培養インキュベーターに慎重に入れます。約4時間後、HPMCを2ミリリットルの0.25%トリプシンで1〜2分間分離し、続いて12ミリリットルの完全増殖培地で反応を中和します。

遠心分離によってHPMCを回収し、ペレットを10ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁して計数します。細胞を完全増殖培地1ミリリットルあたり300,000 HPMCに希釈し、6ウェル培養プレートの各ウェルに2.5ミリリットルの新鮮な完全増殖培地を加えます。

滅菌鉗子を使用して、各インサートの右側を上にして6ウェルプレートの各ウェルに入れ、下部卵巣癌細胞の付着面が培地に浸されるようにします。次に、1.5ミリリットルのHPMCを各インサートのウェルに播種し