0 閲覧数 • 3:34 分 • April 30th, 2023
腹膜、または腹腔を覆う膜は、線維血管結合組織の層の上に支持された腹膜中皮細胞を構成します。転移性卵巣がん細胞はこの腹膜内層に付着し、増殖して癌性増殖します。
卵巣がんの転移をモデル化するには、まずヒト線維芽細胞を円錐形のチューブに取り込み、細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンと混合します。懸濁液を培養皿にプレートします。インキュベートしてコラーゲンマトリックスの固化を促進し、線維芽細胞を埋め込み、腹膜の結合組織を模倣します。
次に、線維芽細胞-コラーゲン層の上に中皮細胞の懸濁液を追加します。プレートをインキュベートして、中皮細胞が接着し、線維芽細胞-コラーゲン層の表面に単層を形成できるようにします。この3D器官型培養は、現在、in vivo腹膜内層の組成と構造を模倣しています。
最後に、この器官型培養物に卵巣がん細胞を播種し、所望の期間インキュベートします。卵巣がん細胞は、中皮層を変化させる特定のシグナル伝達分子を放出し、がん細胞の接着と浸潤を促進し、in vivo 転移状態を模倣します。
正常な大網線維芽細胞を培養から放出するには、培養フラスコを10ミリリットルのPBSですすぎ、続いて3ミリリットルのトリプシンを5分以内にすすぎます。細胞が剥離したら、トリプシンを少なくとも3倍の体積の完全増殖培地で中和し、細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。細胞をスピンダウンし、ペレットを5ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、100マイクロリットルの完全増殖培地濃度あたり2〜4倍10〜3番目の線維芽細胞に希釈します。
次に、100マイクロリットルあたり0.5マイクログラムのラットテールコラーゲンIを細胞に加え、ウェルあたり100マイクロリットルの細胞を黒く透明な底の96ウェルプレートにプレートします。次に、プレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも4時間、または細胞がプレート表面に付着するまで移します。正常な大網線維芽細胞が沈降している間に、HPMCを培養フラスコから切り離し、これらの細胞を50マイクロリットルの完全増殖培地あたり1〜2倍の10〜4番目のHPMCに希釈します。
次に、付着した正常な大網線維芽細胞にウェルあたり50マイクロリットルのHPMCを加え、実験使用前に少なくとも18時間プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。翌日、GFPを発現する卵巣癌細胞との3D器官型共培養物を、目的の下流アッセイの適切な希釈で80%から90%のコンフルエント培養物で播種します。