中皮クリアランスアッセイ:卵巣がんスフェロイドの中皮細胞単層への浸潤能力を定量化するIn Vitro技術

卵巣がんの転移中、悪性細胞は原発腫瘍部位から剥離し、腹腔内を循環し始めます。これらの細胞は、腹腔の内側を覆う中皮細胞単層に付着するクラスターまたはスフェロイドを形成することができます。腫瘍が成長するにつれて、浸潤を促進するために下にある中皮細胞が除去されます。

中皮クリアランスをモデル化するには、まず、緑色の蛍光タンパク質またはGFPを発現する中皮細胞をフィブロネクチンでコーティングされたガラス底培養皿に播種します。フィブロネクチンコーティングは、細胞の付着を促進するマトリックスを提供します。皿をインキュベートして、中皮細胞が広がり、単層を形成できるようにします。

次に、赤色蛍光タンパク質を発現する卵巣癌細胞スフェロイドの懸濁液を中皮単層に移します。タイムラプス蛍光顕微鏡を使用して、培養物を長時間画像化します。赤色蛍光スフェロイドは沈降し、緑色蛍光中皮単層に付着します。

がん細胞は中皮細胞に力を加え、細胞接合部を破壊し、中皮層の完全性を変化させます。この力はまた、下にある中皮細胞を変位させ、穴を生成します。適切なGFPフィルター設定を選択して、結果の穴を画像内の黒いスペースとして視覚化します。空間を測定して、中皮クリアランスの程度を定量化します。

この手順を開始するには、6ウェルガラス底MatTek皿のウェルをフィブロネクチンで事前にコーティングします。2ミリリットルのフィブロネクチン/ PBS溶液を皿の各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートします。緑色の蛍光タンパク質を発現する中皮細胞は、中皮細胞単層を形成するために、10%ベース培地で培養されます。中皮細胞のプレートをトリプシン化し、卓上遠心分離機で900 RPMで3分間スピンダウンします。

上清を吸引し、細胞を10%ベース培地に再懸濁します。10%の塩基培地で所望の濃度に調整します。MatTekディッシュの30分間のフィブロネクチンインキュベーションが完了したら、ウェルを2ミリリットルのPBSで洗浄します。PBSを吸引し、6ウェルMatTekディッシュの各ウェルのウェルごとに5番目の中皮細胞に10回6回プレートします。MatTekディッシュを摂氏37度の細胞培養インキュベーターで一晩インキュベートし、中皮細胞がディッシュに付着して単層を形成できるようにします。

ピペットを使用して、96ウェルのポリHEMAコーティングプレートから卵巣癌スフェロイドを収集します。中皮細胞単層を含む6ウェルMatTekディッシュの1つのウェルから培地を吸引します。2ミリリットルのPBSで一度洗浄します。96ウェルプレートのすべてのスフェロイドをMatTekディッシュの1つのウェルに加えます。これは、画像化できない皿の部分に着地するスフェロイドを説明するために画像化されるスフェロイドの数の約3倍です。

視野ごとに1つの回転楕円体のみを画像化したいため、回転楕円体の集約は避ける必要があります。皿を左右にそっと揺らして、スフェロイドが付着する前に単層全体に均等に分散させます。

MatTekディッシュを、少なくとも8時間のタイムラプスイメージングが可能な倒立広視野蛍光顕微鏡のステージに置きます。電動ステージを使用して、1回の実験で複数のスフェロイドインターカレーションイベントを伴う皿内の複数の位置を画像化します。卵巣癌細胞のスフェロイドは皿の底に沈殿し、中皮細胞単層に付着します。20以上のスフェロイド/単層相互作用のGFP、RFP、および位相画像を10分ごとに8時間収集します。