卵の窓:受精した鶏の卵の殻を開いて絨毛尿膜血管系を露出させる方法

精卵では、絨毛尿膜または CAM は、卵殻内膜の下に位置する高度に血管新生した層です。胚の発生をサポートするように機能します。

完全に発達した CAM を露出させるには、まず卵のキャンドラー (明るい光源) を卵の殻に当てて卵の内部を視覚化します。卵殻の外側と内側の膜と卵内の顕著な分岐血管系の間に空気細胞を見つけます。彼らの位置を外部にマークします。

これらのスポットで、卵の殻に小さな円形の穴を開けて、下にある白い殻の膜を露出させます。CAMを破壊したり、アルブミンや血液の漏れを引き起こしたりすることなく、両方の場所で露出した膜をそっと突き刺します。

卵を縦方向に保ち、自然な空気細胞の開口部に吸引を加えて内部から空気を抜きます。結果として生じる負圧により、CAM が 2 番目の開口部より下に下がり、血管網上に人工空気細胞が生成されます。

再配置されたエアセルの輪郭を描きます。エアセルとCAMの境界を乱すことなく、輪郭の内側の数センチメートルの卵殻を切り取ります。切り開いたシェルを取り除いて大きな窓を作成し、下にある CAM と血管系を露出させます。透明なフィルムを使用して、生存可能な卵の窓を密閉します。

CAMが完全に発達した発育7日目または8日目に、卵回転器をオフにし、約1〜3個の卵をバイオセーフティキャビネットの卵ラックに入れます。ライトを消した状態で、卵の殻に卵のキャンドラーを置き、1つの卵の空気細胞の位置を特定してマークします。次に、卵のキャンドラーを殻の上に移動して大きな血管網を見つけ、必要に応じて卵を回転させます。

理想的な血管系は、卵の中央近くで枝分かれします。マーカーを使用して、移植に使用する血管系をトレースします。フードのライトを再びつけた後、炭化ケイ素砥石を取り付けたコードレス回転工具を使用して、エアセルの中央の真上にあるシェルに小さな穴を開けます。シェルの大部分が取り除かれ、白い内膜が無傷になったら、先ほど示したように血管窓が開く別の小さな穴を開けます。2 番目の穴の準備ができたら、18 ゲージの針を使用して、CAM ではなく白い内膜がドリル領域全体で破壊されるように注意しながら、空気細胞と血管系の白い内膜をそっと突き刺します。

フードライトを再び消した状態で、卵キャンドラーを使用して、エアセルが卵の端から血管系の上の領域に移されたことを確認します。必要に応じて、ピペットコントローラーに挿入された真空チューブを元のエアセルの上の穴の周りに置き、短時間でゆっくりと吸引してエアセルを動かします。エアセルの新しい位置の輪郭をエアCAM境界の内側約0.5センチメートルにマークし、新しいエアセルの穴を覆うのに十分な大きさの梱包テープを固定します。

先ほど示したように他の2つの卵を準備した後、卵をインキュベーターに戻し、示されているように1〜3個のグループで実験のために追加の卵を開きます。すべての卵が開いたら、エアセルを移動させた1〜3個の卵をバイオセーフティキャビネットの卵ラックに移し、円形のカッティングホイールを取り付けたコードレス回転ツールを使用して、CAMまたは血管系を破壊することなく、セルを完全に通すエアセルの境界に小さな線を切ります。湾曲したハサミを使用して、残りの空気細胞の周りを切り取り、シェルにウィンドウを作成し、胚の生存率を確認します。

生存可能な胚は、広範な血管系、透明な卵白、胚の動き、および/または目に見える心拍を示します。生存不可能な胚では、CAMは不透明に見え、血管が存在するとしてもほとんどなく、胚は小さいか、動きや心拍がない可能性があります。セムケン鉗子を使用して、滅菌綿球から綿の小片を引き出し、生存可能な胚のCAM表面を優しく吸い取り、殻のほこりや破片を取り除きます。次に、CAMに触れずに6 x 7センチメートルの透明フィルムドレッシングの4分の1で殻の開口部を覆い、開いた窓を上に向けて卵をインキュベーターに戻します。エッグラック、エッグローテーターの端、またはその他の適切なアイテムを使用して、転がり続ける卵を支えます。