アガローススピンダウンアッセイ:組織学的解析のためのオルガノイドを埋め込む技術

癌細胞の3Dオルガノイド培養はヒト癌の多くの病態生理学的特徴を再現するしたがって、これらの in vitro 培養は、がん研究の優れたモデルを形成します。

これらのオルガノイドを処理するには、適切な基底膜マトリックスで増殖した事前に形成された3Dオルガノイドの培養から始めます。目的の細胞回収培地を加えてインキュベートします。培地はマトリックスゲルの解重合を促進し、3Dオルガノイドを溶液中に放出します。

この混合物を遠心分離してオルガノイドをペレット化します。マトリックス成分を含む回収培地は上清に残ります。上清を捨てます。次に、オルガノイドペレットにパラホルムアルデヒド溶液を加えます。この化学物質はオルガノイド細胞に入り、アミノ酸に結合し、タンパク質の架橋とサンプルの固定を引き起こします。このステップは、下流の組織学的アプリケーションにとって不可欠です。

オルガノイドをペレット化して、パラホルムアルデヒド含有上清を分離および除去します。温かく溶かしたアガロースをオルガノイドに加えます。針を使用して、ペレット状のオルガノイドを取り外し、液体アガロースに分散させます。アガロースを固化させ、オルガノイドを埋め込みます。オルガノイド含有アガロースプラグを下流の組織学的アッセイに使用します。

組織学のためにオルガノイドを処理するには、基底膜ドームを吸引しないように注意しながら、既存の培地をウェルから取り除きます。等量の細胞回収溶液を加え、プレートを摂氏4度で60分間インキュベートします。

インキュベーション後、ピペットを使用して基底膜ドームを取り除き、ピペットチップで粉砕します。解離したドームと細胞回収液を1.5ミリリットルのチューブに集めます。チューブを300 x g、摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を取り除いて脇に置きます。

オルガノイドの存在が確認される最終ステップまで、すべての上清を保存します。必要な量の冷たいPBSを加え、オルガノイドを破壊することなくペレットを機械的に取り除くために、ゆっくりと上下にピペットします。遠心分離を繰り返し、上清を除去します。

ペレットを4%PFAの一致した容量で室温で60分間固定します。固定後、遠心分離ステップとPBS洗浄を繰り返します。次に、200マイクロリットルの温かい2%アガロースをゆっくりと加え、1ミリリットルの注射器に取り付けられた25ゲージの針を使用して、細胞ペレットをチューブ壁から混乱させることなく、すぐに、しかし穏やか

に分離します。

アガローススピンダウン法では、25ゲージの針を使用してアガロースを添加した直後に細胞ペレットをチューブの壁から剥離することが重要です。

アガロースが完全に固まったら、25 ミリリットルの注射器に取り付けた 1 ゲージの針でチューブからアガロースを取り外し、新しい 1.5 ミリリットルのチューブに移します。チューブに70%エタノールを充填し、組織脱水とパラフィン包埋のための従来のプロトコルに進みます。