前立腺オルガノイドアッセイ:前立腺上皮細胞の分化能力を研究するためのマトリックスゲルリングベースのex vivo培養技術

前立腺上皮は、主に基底上皮細胞と管腔上皮細胞で構成されています。基底細胞の単層は腺の外層を形成し、管腔細胞の生存をサポートします。逆に、管腔細胞は内腔の内側を覆い、前立腺特異的タンパク質を分泌します。

前立腺上皮の分化を ex vivo で研究するには、基底前立腺上皮細胞の懸濁液から始めます。懸濁液を冷却した基底膜マトリックスと所望の比率で混合します。この混合物を細胞忌避培養プレートの内壁の基部の隣にピペッティングします。混合物のプレートを回転させて、井戸の円周に沿ってリングを形成します。

プレートをインキュベートして、マトリックスを固化させます。好ましい培地で培養物を補います。培地中の成長因子は、基底上皮細胞の増殖をサポートします。同時に、培養皿の細胞忌避性により、細胞の付着が防止され、細胞がマトリックス内に3Dスフェロイドを形成することが促進されます。

時間が経つにつれて、スフェロイドは多層上皮に縁取られた内腔を発達させます。内腔内層の基底上皮細胞は最終的に分化して分泌管腔細胞を形成し、3D腺構造を生じさせます。

この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、マウス基底および管腔前立腺上皮細胞の調製から開始します。細胞ペレットを500マイクロリットルのマウスオルガノイド培地で洗浄します。次に、ペレットを1マイクロリットルあたり1,000細胞の細胞密度で再懸濁します。マスターミックスを調製するには、マウスオルガノイド培地に懸濁した上皮細胞をマトリックスゲルと混合して、培地中の細胞25%とマトリックスゲル75%を含む最終混合物を生成します。下流の用途に応じて、基底細胞は通常、80マイクロリットルあたり100〜2,000細胞の濃度でプレーティングされますが、管腔細胞は80マイクロリットルあたり2,000〜10,000細胞の濃度でプレーティングされます。

各細胞混合物について、24ウェルプレートのウェルあたり80マイクロリットルのマトリックスゲルを追加します。ポリHEMAコーティングとの直接接触を避けながら、ウェルの壁の下半分に液滴をピペットで流します。マトリックスゲルを加えた後、プレートを旋回させて、マトリックスゲルセル混合物がウェルの縁の周りにリングを形成できるようにします。24ウェルプレートを摂氏37度の5%CO2インキュベーターに右側を上にして10分間入れ、マトリックスゲルを部分的に硬化させます。

10分間インキュベートした後、24ウェルプレートを逆さまにしてさらに50分間インキュベートして、マトリックスゲルを完全に硬化させます。次に、350マイクロリットルの予熱したマウスオルガノイド培地を、各ウェルの中心に滴下的に加えます。培地を追加した後、24ウェルプレートをインキュベーターに戻します。

マウスオルガノイド培地を補充するには、24ウェルプレー