タンパク質ライセート抽出:オルガノイドを溶解して細胞タンパク質を収集する技術

細胞溶解物、または溶解された細胞内容物を含む液体は、タンパク質の抽出や分析などの下流プロセスに応用されます。これらの画分を研究すると、細胞の特徴と機能に関する情報が明らかになります。

オルガノイドタンパク質溶解物を調製するには、所望の基底膜マトリックスで増殖したオルガノイドの培養から始めます。使用済み培地を皿から取り出します。マトリックスの上にプロテアーゼを含む温かい培地を追加します。繰り返しピペットでマトリックスを皿から取り除きます。

混合物をインキュベートします。培地中のタンパク質分解酵素はマトリックスを分解し、オルガノイドを溶液中に放出します。サンプルを遠心分離して、酵素含有上清からオルガノイドを分離します。

オルガノイドペレットを適切なタンパク質溶解バッファーに再懸濁します。サンプルをインキュベートします。緩衝液中の界面活性剤はオルガノイドの細胞膜を破壊し、細胞内の内容物を溶液中に放出します。同時に、バッファー中のタンパク質阻害剤は、遊離されたプロテアーゼおよびホスファターゼ酵素を不活性化し、基質タンパク質の分解を防ぎます。

さらに、混合物を超音波処理して細胞を完全に破壊します。核膜が破裂し、核タンパク質が溶液中に放出されます。音波はまた、放出された核酸をせん断し、タンパク質溶解物を汚染するのを防ぎます。

オルガノイドを収集するには、1ミリリットルの予熱したディスパーゼ含有培地をマトリックスゲルリングに直接ピペッティングして、リング全体が外れるまでマトリックスゲルを繰り返しブラストします。外れたマトリックスゲルオルガノイド混合物を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。完全な消化後、テキストプロトコルに記載されているように、リン酸緩衝生理食塩水をオルガノイドペレットに加え、軽くフリックして再懸濁します。

室温で800 x g で5分間遠心分離してオルガノイドをペレット化し、マイクロピペットを使用して上清を除去します。オルガノイドペレットを、充填細胞体積10マイクロリットルあたり100マイクロリットルのタンパク質溶解バッファーに再懸濁します。フリックしてサスペンドします。次に、チューブを湿った氷に浸し、音波消去器の先端を微量遠心チューブの外側にそっと当てて、オルガノイドを超音波処理します。確立されたプロトコルでウェスタンブロッティングに進む前に、20kHzで40秒間超音波処理します。