0 閲覧数 • 4:33 分 • April 30th, 2023
化学療法耐性細胞を生成するには、まずヒト前立腺がん細胞懸濁液を培養フラスコに収めます。フラスコをインキュベートして、細胞の接着とそれらの分裂を促進して単層を形成します。
細胞に最適な濃度の抗がん剤溶液を補充し、インキュベートします。薬物分子は細胞に入り、感受性細胞のアポトーシスを誘導します。
一部の細胞は、定期的に薬物を除去する特別な薬物流出トランスポーターまたはポンプを発現します。このメカニズムにより薬物の蓄積が防止され、これらの細胞が抗がん剤の効果に耐え、化学療法耐性を持つようになります。
培養物から薬物および破片を含む培地を吸引します。化学療法耐性細胞の増殖をサポートするために、新しい薬物を含まない増殖培地を補充します。使用済み培地を廃棄します。細胞をトリプシン処理して培養フラスコから分離し、チューブに移します。
チューブを遠心分離して細胞をペレット化します。トリプシン含有上清を除去します。細胞を新鮮な増殖培地に再懸濁します。新しい培養フラスコで細胞を増殖させます。
その後、薬物治療と細胞培養のステップを繰り返して、化学療法耐性細胞を同じ抗がん剤の漸増用量にさらします。この技術は、すべての敏感な細胞を排除して培養物をスクリーニングし、化学療法耐性の高い生存細胞のプールを生成します。
この手順を開始するには、20ミリリットルの培地を含む150センチメートル四方のフラスコにDU145または22Rv1細胞をプレートします。24時間後、細胞が約70%から80%のコンフルエンスになったら、5ナノモルでドセタキセルを追加します。
72時間後、薬物含有培地を吸引し、新鮮なドセタキセルフリー培地を追加します。3〜4日ごとに培地を交換し、クローンがフラスコに表示されるまで1〜2週間待ちます。メディアを吸引します。細胞を15ミリリットルのPBSで注意深く洗浄し、4ミリリットルの0.05%トリプシン-EDTAと摂氏37度で3〜5分間インキュベートして、細胞をフラスコ表面から切り離します。次に、8ミリリットルの新鮮な培地を使用して、フラスコからトリプシン化した細胞を再懸濁します。
処理されたすべてのフラスコから細胞をプールし、遠心分離によってペレット化します。その後、上清を取り除きます。細胞ペレットを20ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁し、150センチメートル四方のフラスコに細胞をプレーティングします。
24時間後、細胞が約70%から80%のコンフルエンスになったら、5ナノモルのドセタキセルを再度加えます。クローンがフラスコに表示されるまで、前に示した手順を繰り返します。次に、細胞を150センチメートル四方のフラスコに再度プレートします。
24時間後、細胞が約70%から80%のコンフルエンスになったら、10ナノモルのドセタキセルで処理します。ドセタキセルの用量漸増方法で同じ手順を繰り返し、濃縮処理のたびに生き残ったクローンをプールし続けます。プロセスの最後に、実験的に使用できる耐性細胞のプールが得られます。