機能的化学抵抗性特性評価:クローン生成アッセイを用いたがん細胞の薬剤耐性評価法

がん細胞の化学療法耐性を評価するには、まずマルチウェルプレートを採取します。目的の薬剤感受性前立腺癌細胞の懸濁液をいくつかのウェルに播種し、細胞の薬剤耐性変異体の懸濁液を残りのウェルに播種します。

培養プレートへの細胞の付着を促進するために培養物をインキュベートします。選択した薬液の用量を広範囲で両方の細胞型で処理します。薬物分子は敏感な細胞に入り、最低濃度でも細胞死を引き起こします。しかし、耐性細胞は特殊な薬物流出ポンプを介して薬物分子を排出し、より高い薬物濃度にさらされても生存を可能にします。

破片や薬液を含む使用済み培地を吸引します。新鮮な薬物を含まない増殖培地を補給します。インキュベートして、生き残った薬剤耐性細胞が増殖してコロニーを形成できるようにします。生細胞コロニーを着色するために適切な染色液を加えます。

培養物を洗浄して余分な染料を取り除きます。各ウェル内の色付きのコロニーの数を数えます。薬物感受性細胞を含むウェルには、生存可能なコロニーがほとんどありません。対照的に、薬剤耐性細胞を含むウェルは、より多くのコロニーを示します。しかし、これらの薬剤耐性細胞は、薬物投与量の増加に伴いコロニー数の減少を示します。

この手順では、6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルの培地を使用して2,000細胞をプレートします。24時間後、DU145細胞株と22Rv1細胞株の両方に濃度を上げるドセタキセルを追加します。DMSOは、ドセタキセルの最高用量に使用されるのと同じ容量で、コントロールとして1つのウェルにのみ追加します。72時間後、薬物含有培地を吸引し、新鮮なドセタキセルフリー培地を追加します。

コロニーが顕微鏡下で見えるまで、プレートを1〜2週間インキュベートします。コロニーを染色するには、2〜3ミリリットルのPBSで穏やかに洗浄し、組織培養フードまたはヒュームフード内で2〜3ミリリットルのクリスタルバイオレット溶液と20分間インキュベートします。

その後、染色液を取り除き、プレートを2〜3ミリリットルの水で洗浄します。次に、水を取り除き、プレートを自然乾燥させます。図形表現用のプレートのデジタル画像を撮影します。ウェルを視覚化し、マーカーペンを使用してコロニーを手動でカウントして結果を分析し、細胞生存率のパーセンテージをグラフで表します。