ADIによる前立腺がん細胞のオートファジー誘導:酵素を用いた細胞のオートファジー応答測定技術

オートファジーは、リソソームと呼ばれる特殊な消化コンパートメント内の不要な細胞質成分や細胞小器官の分解を促進する細胞内プロセスです。オートファジーを評価するには、緑色蛍光タンパク質に結合したLC3と呼ばれるオートファジーマーカータンパク質を発現する前立腺がん細胞の接着培養から始めます。

的に、前立腺がん細胞は、アルギニンアミノ酸合成に必要な酵素アルギニノコハク酸シンターゼを欠いています。したがって、これらの細胞は、生存と増殖のために培地を介した外部アルギニン補給に依存しています。

次に、細胞をアルギニンデイミナーゼまたはADIで処理します。アナログ・デバイセズは培地中の遊離アルギニンを加水分解し、アルギニンの枯渇を引き起こします。その結果、細胞は代謝ストレスを受け、内部でオートファジー反応を開始します。同時に、細胞内のリソソームを標識する赤色蛍光色素で細胞を処理します。

オートファジー中、ファゴフォアと呼ばれるカップ状の膜構造が損傷した細胞質成分の周囲に集まります。最終的に、それらはオートファジーマーカータンパク質LC3と結合して二重膜小胞またはオートファゴソームを形成しながら、貨物を膨張させて密封します。LC3タンパク質は、オートファゴソームに蛍光タグも提供します。次に、小胞はリソソームと融合してオートリソソームを形成します。オートリソソーム内のリソソームプロテアーゼは、飲み込まれた細胞成分を分解します。

ファゴソームとリソソームからの明るい蛍光をリアルタイムで観察して、細胞内の分布を決定します。

まず、テキストプロトコルに記載されているように、35ミリメートルのポリD-リジンでコーティングされたガラス底培養皿上で、緑色の蛍光タンパク質共役軽鎖3を発現するヒト前立腺癌細胞を増殖させます。

細胞は、急速な増殖を促進するために十分な密度でプレーティングする必要がありますが、イメージング時までに細胞が過度に成長して凝集するほどではありません。選択した細胞サンプルをPBS中のアルギニンデアミナーゼ(ADI)で処理して、細胞から遊離アルギニンを枯渇させ、がん細胞に代謝ストレスを誘発します。

イメージングの約1時間前に、1.5マイクロリットルのLysoTracker Redを10%のFBSと1%の抗生物質を含む20ミリリットルのRPMIで希釈します。処理された選択したサンプルの溶液をアナログ・デバイセズで調製します。

すべての培地を摂氏37度に温めた後、各培養皿に適切な培地を追加します。LysoTracker Redを含むRPMIで細胞を摂氏37度で15〜45分間インキュベートします。

イメージングの約30分前に、気象観測所の環境エンクロージャーの電源を入れ、摂氏37度、二酸化炭素5%まで平衡化します。PBSで細胞を洗浄し、10%のFBSと1%の抗生物質のみを含む標準的なRPMIに培地を置き換えます。

指示に従って、ADIをサンプルに追加します。35mmのカバーガラス底培養皿をカスタマイズされたアダプターに取り付けます。倍率60倍、開口数1.42の対物レンズに浸漬油を使用し、取り付けられた培養皿を顕微鏡ステージに配置します。

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.