JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 4:03 分 • April 30th, 2023
前立腺腫瘍組織サンプルから始めます。冷やした溶解バッファーに再懸濁して、細胞溶解を開始します。ホモジナイザーを使用して組織構造をさらに分解し、細胞内成分を放出します。サンプルを氷上で超音波処理して完全な細胞溶解を確実にし、DNAをせん断してペプチド処理中の干渉を防ぎます。ライセートを加熱してタンパク質の三次構造を破壊し、展開します。
緩衝液中の還元剤は、システイン残基間のジスルフィド結合を切断します。続いて、緩衝液中のアルキル化剤は、還元型システインの遊離チオール基をアルキル化して、ジスルフィド結合の再形成を防ぎます。バッファー中の追加の変性剤は、制御された変性とタンパク質のさらなるアンフォールディングを促進します。
遠心分離機で組織の破片や汚染物質をペレット化します。タンパク質混合物を含む上清を新鮮なチューブに集めます。リシルエンドペプチダーゼ酵素を添加して、リジン残基のC末端でタンパク質のペプチド結合を切断し、大きなペプチドを形成します。さらに、酵素トリプシンで処理して、リジン残基とアルギニン残基のC末端でペプチド結合を切断し、より小さなペプチドを生成します。混合物を遠心フィルターユニットに移します。
遠心分離機で、消化されたペプチドがフィルター膜の細孔を通って浸透し、フロースルーとして収集できるようにします。より大きなフラグメントは保持物として残ります。
腫瘍組織を採取するには、腫瘍の重量を量り、培養試験管に、組織100ミリグラムごとに2ミリリットルの氷冷溶解バッファーを加えます。次に、ハンドヘルドまたはベンチトップホモジナイザーを使用してライセートをホモジナイズします。
サンプルを還元してアルキル化するには、チューブを摂氏95度で5分間加熱し、次にサンプルを氷上で15分間冷却します。まだ氷上にある間に、溶解物を3回超音波処理します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。
この超音波処理チューブをスイングバケットローターに入れ、ライセートを3,500 x gおよび摂氏15度で15分間遠心分離します。次に、上清を集めてペレットを捨てます。ライセートを消化するには、100ミリモルのトリスを使用してサンプルを12倍に希釈し、グアニジニウムの量を減らします。5ミリグラムのタンパク質に対して、10マイクログラムのリシルエンドペプチダーゼ(Lys-C)を加え、サンプルを室温で5〜6時間インキュベートします。
1ミリモルの塩化カルシウムとトリプシンを1〜100トリプシンの比率で添加した1ミリモルHCl中のTPCK処理トリプシンを1ミリリットルあたり調製します。サンプルを摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、トリプシンのアリコートをチューブに追加し、サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートします。
サンプルを15ミリリットル、10 kDaのカットオフフィルターに加えます。スイングバケットまたは固定角度ローターで、保持量が250マイクロリットル未満になるまで、3,500 x g、摂氏15度でサンプルを遠心分離します。次に、フロースルーを回収し、残留物を廃棄します。