タンパク質抽出とタンパク質分解:前立腺腫瘍組織サンプルからのタンパク質の取得方法とペプチドへの酵素消化

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前立腺腫瘍組織サンプルから始めます。冷やした溶解バッファーに再懸濁して、細胞溶解を開始します。ホモジナイザーを使用して組織構造をさらに分解し、細胞内成分を放出します。サンプルを氷上で超音波処理して完全な細胞溶解を確実にし、DNAをせん断してペプチド処理中の干渉を防ぎます。ライセートを加熱してタンパク質の三次構造を破壊し、展開します。

緩衝液中の還元剤は、システイン残基間のジスルフィド結合を切断します。続いて、緩衝液中のアルキル化剤は、還元型システインの遊離チオール基をアルキル化して、ジスルフィド結合の再形成を防ぎます。バッファー中の追加の変性剤は、制御された変性とタンパク質のさらなるアンフォールディングを促進します。

遠心分離機で組織の破片や汚染物質をペレット化します。タンパク質混合物を含む上清を新鮮なチューブに集めます。リシルエンドペプチダーゼ酵素を添加して、リジン残基のC末端でタンパク質のペプチド結合を切断し、大きなペプチドを形成します。さらに、酵素トリプシンで処理して、リジン残基とアルギニン残基のC末端でペプチド結合を切断し、より小さなペプチドを生成します。混合物を遠心フィルターユニットに移します。

心分離機で、消化されたペプチドがフィルター膜の細孔を通って浸透し、フロースルーとして収集できるようにします。より大きなフラグメントは保持物として残ります。

腫瘍組織を採取するには、腫瘍の重量を量り、培養試験管に、組織100ミリグラムごとに2ミリリットルの氷冷溶解バッファーを加えます。次に、ハンドヘルドまたはベンチトップホモジナイザーを使用してライセートをホモジナイズします。

サンプルを還元してアルキル化するには、チューブを摂氏95度で5分間加熱し、次にサンプルを氷上で15分間冷却します。まだ氷上にある間に、溶解物を3回超音波処理します。次に、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。

この超音波処理チューブをスイングバケットローターに入れ、ライセートを3,500 x gおよび摂氏15度で15分間遠心分離します。次に、上清を集めてペレットを捨てます。ライセートを消化するには、100ミリモルのトリスを使用してサンプルを12倍に希釈し、グアニジニウムの量を減らします。5ミリグラムのタンパク質に対して、10マイクログラムのリシルエンドペプチダーゼ(Lys-C)を加え、サンプルを室温で5〜6時間インキュベートします。

1ミリモルの

塩化カルシウムとトリプシンを1〜100トリプシンの比率で添加した1ミリモルHCl中のTPCK処理トリプシンを1ミリリットルあたり調製します。サンプルを摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、トリプシンのアリコートをチューブに追加し、サンプルを摂氏37度で一晩インキュベートします。

サンプルを15ミリリットル、10 kDaのカットオフフィルターに加えます。スイングバケットまたは固定角度ローターで、保持量が250マイクロリットル未満になるまで、3,500 x g、摂氏15度でサンプルを遠心分離します。次に、フロースルーを回収し、残留物を廃棄します。

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最終更新:22 8月 2026