JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 3:21 分 • April 30th, 2023
ペプチドを単離して精製するには、消化されたペプチドの混合物を含むタンパク質ライセートの懸濁液から始めます。
混合物をトリフルオロ酢酸またはTFAベースの試薬で処理します。この陰イオン性または負に帯電した試薬は、ペプチド上に塩基性または正に帯電した残基とイオン対複合体を形成し、ペプチドの電荷をマスクし、ペプチドの疎水性を改善します。
次に、非極性疎水性リガンドで固定化された多孔質シリカベースの固定相を含む逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)カラムを組み立てます。ペプチド適合平衡バッファーをカラムに追加して、サンプル適用前に固定相を調製します。
次に、酸性化したサンプルをカラムにロードします。カラム内では、疎水性ペプチドが固定相の疎水性リガンドに選択的に吸着します。洗浄バッファーをカラムに通し、結合していない粒子や不要な粒子を溶出します。
次に、疎水性の高い極性の低い有機溶出バッファーをカラムに通します。溶出バッファーに対する選択的親和性により、結合したペプチドはカラムマトリックスから脱着します。
ペプチド含有溶出液をカラムから回収します。溶出液を凍結乾燥して水分含有量を除去し、純粋で安定したペプチドの乾燥粉末を得る。
サンプルを酸性化するには、ライセート1ミリリットルあたり約20マイクロリットルの5%トリフルオロ酢酸(TFA)を加えます。チューブをよく混ぜ、pHストリップを使用してpHを測定します。必要に応じて、さらに5%TFAを追加して、pHを2.5に調整します。次に、C18カラムの短い方の端を真空マニホールドに接続します。真空を17〜34 kPaに設定した後、3ミリリットルの100%アセトニトリルとガラスピペットを使用してカラムを濡らします。
ガラスピペットを使用し、0.1% TFA の 3 ミリリットルのアリコートを 2 回塗布して、カラムを平衡化します。次に、酸性化したサンプルをカラムにロードします。3 ミリリットル容量の 0.1% TFA を 3 回使用してカラムを洗浄します。次に、2ミリリットルの40%ACN、0.1%TFAを塗布してサンプルを溶出し、2ミリリットルの画分を2つガラス培養チューブに集めます。パラフィルムを使用して、溶出チューブを覆い、20ゲージの針を使用してカバーに3〜5つの穴を開けてから、サンプルを一晩凍結乾燥します。