0 閲覧数 • 4:50 分 • April 30th, 2023
チロシンなどの特定のアミノ酸残基のリン酸化は、いくつかの細胞シグナル伝達経路の調節に重要な役割を果たすホスホペプチドを生成します。これらを研究することで、がん治療の潜在的なバイオマーカーを特定できます。
ホスホペプチドを単離するには、がん組織から抽出した精製ペプチド消化物の凍結乾燥粉末から始めます。粉末を適切なバッファーに再存在させて、均一なペプチド懸濁液を調製します。ペプチドの安定性を確保するために、中性のpHを維持します。
目的のバッファー中で特異的抗ホスホペプチド抗体に結合したヒドロゲルビーズからなるスラリーを調製します。ビーズスラリーをペプチド懸濁液に加えます。ビーズに固定化された抗体は、ホスホペプチド内の特定のリン酸化アミノ酸残基を認識して結合し、複合体を形成します。
混合物を遠心分離して、ペレット中のホスホペプチド-ビーズ複合体を収集します。非結合ペプチドまたは非特異的ホスホペプチドを含む上清を除去します。適切な低pH溶出バッファーを複合体に加え、インキュベートします。pHが低いと、ホスホペプチド残基と抗体ビーズ複合体の間の相互作用が弱まり、ペプチドが溶液中に放出されます。
混合物を組み立て済みのフィルターカートリッジに移します。遠心分離機で放出されたホスホペプチドを収集チューブに溶出させます。サンプルを高温で真空濃縮して緩衝液を除去し、純粋なホスホペプチドの濃縮乾燥ペレットを得る。
凍結乾燥粉末を、各画分に0.5ミリリットルの氷冷免疫沈降(IP)結合バッファーで再懸濁します。0.5ミリリットルの再懸濁液量を2番目の画分から最初の画分を含むチューブに移し、ピペットチップを保存します。さらに0.5ミリリットルのIPバッファーを使用して、内容物をクライオチューブに移す前に、各凍結乾燥チューブをすすぎます。次に、2ミリリットルのIPバッファーを使用してすすぎを繰り返します。
チップをカットしたP200を使用して、抗体ビーズスラリーの1ミリリットルあたり0.5ミリグラムのストックをマイクロフュージチューブに移した後、450マイクロリットルの氷冷IP結合バッファーを加えて、50マイクロリットルの4G10抗体ビーズスラリーと25マイクロリットルの27B10.4抗体ビーズスラリーをマイクロフュージチューブで洗浄します。チューブを100 x g、摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を吸引した後、IP結合バッファーの元のスラリーと同量を加えてビーズを再懸濁します。スクリューキャップクライオチューブ内の再懸濁サンプル溶液に、事前に洗浄したpYビーズを追加します。次に、エンドオーバーエンドローテーターで摂氏4度で一晩インキュベートします。ビーズを回転させた後、pSTペプチドの濃縮に使用される上清を保存します。
次に、300マイクロリットルのIP結合バッファーを使用してビーズを再懸濁し、2ミリリットルの微量遠心チューブに移します。サンプルを100 x g、摂氏4度で1分間回転させます。次に、500マイクロリットルのIP結合バッファーで、ビーズを3回洗浄します。ビーズを450マイクロリットルの25 mM重炭酸アンモニウム、pH 7.5で4回洗浄します。ゲルローディングチップをビーズ表面の少し下に浸し、上清を完全に吸引します。ビーズ体積の 4 倍の 0.1% TFA をビーズに加えます。
次に、それらをよく混合し、チューブをサーモミキサーで1,000rpm、摂氏37度で15分間インキュベートします。再懸濁液を0.2マイクロメートルのスピンフィルターに移し、フィルターを850 x g で1分間遠心分離します。溶出液を低タンパク質結合微量遠心チューブに移した後、溶出液を真空濃縮し、摂氏40度で乾燥させ、加熱時間300分で一晩します。