ゲノムDNAのバイサルファイト変換:消化器癌組織からのゲノムDNAサンプル中のDNAメチル化を研究する方法

DNAメチル化は、DNAのシトシン残基にメチル基を付加してメチルシトシンを形成し、DNAの変化と遺伝子発現調節を引き起こします。

DNAメチル化を研究するには、がん細胞から粗DNA抽出物を採取することから始めます。希釈バッファーを加え、室温でインキュベートします。バッファーは混合物を希釈し、二本鎖DNAを一本鎖DNAに変性させ、その後の反応のための塩基へのアクセスを促進します。

変換試薬を加え、暗所でインキュベートします。試薬中の亜硫酸水素ナトリウムは、メチル化されていないシトシン残基のスルホン化とその後の脱アミノ化を引き起こし、ウラシル-スルホン酸塩の形成をもたらします。ただし、メチル化シトシン残基は変化しません。

次に、DNAに結合バッファーを補充し、組み立て済みのスピンフィルターカラムに移します。バッファーは、DNAがフィルターに結合するのを助けます。

遠

心分離して、カラム内に閉じ込められたDNAからバッファーと亜硫酸水素塩試薬混合物を除去します。フロースルーを破棄します。DNAにアルカリ性脱スルホン化バッファーを添加します。この緩衝液は、ウラシル-スルホン酸塩から亜硫酸塩基を除去してウラシルを形成するのを助けます。

遠心分離して使用済みバッファーを除去します。次に、溶出バッファーをカラムに追加して、変換されたDNAを溶出します。PCRを実行してDNAを増幅します。変換されたすべてのウラシル残基はチミンとして増幅されますが、メチル化されたシトシン残基はシトシンとして増幅されます。

増幅されたDNAのシトシン残基を配列決定して、サンプルのメチル化プロファイルを生成します。

製造元の指示に従って、亜硫酸水素塩変換キットを使用して、消化された組織の45マイクロリットルに亜硫酸水素塩処理を実行します。サンプルに5マイクロリットルの希釈バッファーを加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。一方、750マイクロリットルの蒸留水と210マイクロリットルの希釈バッファーを1本のCT変換試薬に加えて、亜硫酸水素塩変換試薬を調製します。チューブを10分間ボルテックスして混合します。次に、調製したCT変換試薬100マイクロリットルを各サンプルに加え、反転で混合します。

サンプルを摂氏50度の暗所で12〜16時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを氷上に10分間置きます。400マイクロリットルの結合バッファーを加え、上下にピペッティングして各サンプルを混合します。各サンプルをスピンカラムにロードし、カラムを2ミリリットルの収集チューブに入れます。サンプルを全速力で1分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。各カラムに200マイクロリットルの洗浄バッファーを加え、フルスピードで1分間回転させてから、フロースルーを廃棄します。

各カラムに200マイクロリッ