ガラス固化法による凍結保存:生物試料を超低温で長期保存するための超急速冷却技術

超高速凍結保存技術であるガラス化により、生きた細胞や組織を冷却し、極低温で非常に長期間保存することができます。

採取したばかりの腫瘍組織をガラス化するには、まず、組織を培養プレートに取り出します。腫瘍から壊死領域、脂肪含有領域、または血栓を切除します。組織を洗浄して、血液の痕跡を取り除きます。

組織を適切な厚さのスライスに切ります。次に、スライスをDMSO(ジメチルスルホキシド)とスクロースを構成するガラス化溶液を含むチューブに移します。これらの成分は凍結保護剤として作用し、凍結による損傷から細胞を保護します。

低温でインキュベートします。細胞透過性凍結保護剤であるDMSOは、細胞膜を横切って拡散し、細胞内の水分を置き換えて細胞内の氷結晶形成を防ぎます。同時に、非透過性凍結保護剤であるスクロースは、細胞の脱水を促進し、細胞内の氷結晶形成を減少させて細胞死のリスクを軽減することにより、細胞外で作用します。

平衡化された腫瘍スライスを組織ホルダーに置きます。次に、このアセンブリを液体窒素に移し、摂氏マイナス196度で凍結します。この急速冷却により、サンプルのガラス化が行われ、組織がガラス状のアモルファス状態に固化され、高濃度の凍結保護剤が氷の結晶形成や細胞損傷を防ぎます。

ガラス化組織は、代謝活動が停止した状態のままです。

マウスを安楽死させた後、滅菌鉗子とハサミを使用して、マウスから腫瘍をゆっくりと分離します。DPBSと10センチの皿で腫瘍組織を洗浄します。鉗子とハサミを使用して、壊死領域、脂肪組織、血栓、結合組織を解剖して除去します。

次に、型を使用して腫瘍組織を最大厚さ1ミリメートルに切断します。腫瘍スライスを10センチの皿でDPBSで洗浄します。ガラス化プロセスを開始するには、鉗子を使用してスライスをチューブV1に移し、摂氏4度で4分間インキュベートします。チューブを短時間転がして反転させ、摂氏4度でさらに4分間インキュベートします。

次に、V1溶液とスライスを10センチの皿に注ぎ、鉗子を使用してスライスをチューブV2に移します。摂氏4度で4分間インキュベートします。チューブを短時間転がして反転させ、摂氏4度でさらに4分間インキュベートします。この後、V2溶液とスライスを10センチの皿に注ぎます。

スライスをチューブV3に移し、摂氏4度で5分間インキュベートします。チューブを短時間転がして反転させ、摂氏4度でさらに5分間インキュベートします。

すべてのスライスがチューブの底に沈むようにしてください。いくつかのスライスが浮いたままである場合は、チューブを短時間転がして反転させ、すべてのスライスが完全に沈むまで摂氏4度でインキュベートします。次に、V3溶液とスライスを10センチの皿に注ぎます。ティッシュホルダーを適切な長さにカットし、滅菌ガーゼの上に置きます。スライスをホルダーに移します。ホルダーをガーゼで包みます。

鉗子を使用して、ホルダーを液体窒素に入れ、5分間インキュベートします。この後、極低温バイアルに組織情報をラベル付けします。組織スライスを含むホルダーをバイアルに移し、液体窒素に保管します。