腹膜低密度好中球単離:磁気活性化細胞選別法による腹膜洗浄液からの低密度好中球取得技術

低密度好中球 (LDN) は、消化器がんなどの病的状態中に増加して見られる明確な好中球亜集団です。LDN は、患者の腹腔洗浄液または洗浄液から分離できます。

まず、洗浄液をろ過して組織の破片を取り除きます。濾液を遠心分離して、LDNを含む血球を含むペレットを得る。適切な緩衝液に再懸濁する。この懸濁液を、LDN単離に最適な適切な密度勾配媒体の上に層

心分離機は、相対密度に基づいてさまざまな血液成分を分離します。密度の高い赤血球が最下層を形成し、密度の低い血漿画分が最上層を形成します。密度の低いLDNは、他の単核細胞とともに中間層

中間層をブロッキング試薬を含む新しいチューブに移します。試薬成分は、すべての非標的細胞表面の非特異的結合部位をブロックし、その後の標識中にLDNの特異性を高めます。

LDN上で過剰発現した特定の細胞表面分子を標的とする抗体結合マイクロビーズを追加します。抗体ビーズ複合体がLDN上の標的分子に結合するまでインキュベートします。

インキュベートした懸濁液を磁場中に配置されたカラムに通します。磁気の影響下で、すべてのLDN-マイクロビーズ複合体がカラム壁に付着し、標識されていない細胞が通過します。

列を削除します。適切なバッファーを使用して内容物を洗い流し、LDN含有画分を溶出して回収します。

好中球を獲得するには、まず、消化管悪性腫瘍のために腹部手術を受けたばかりの患者の腹腔に直接、創傷閉鎖直前に1リットルの生理食塩水を注入し、腹腔を少なくとも1分間広範囲に洗浄します。次に、キャビティ内の生理食塩水をかき混ぜ、4 本の 50 ミリリットルの注射器で 200 ミリリットルの洗浄液を回収します。

研究室では、腹膜洗浄液を 100 マイクロメートルのナイロン フィルターを通して個々の 50 ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。ペレットを0.02%EDTAを添加した5ミリリットルのPBSに再懸濁し、各細胞懸濁液を3ミリリットルの密度勾配溶液に慎重に重ねます。密度勾配分離後、各チューブから2〜3ミリリットルの中間層を採取し、チューブあたり10ミリリットルの新鮮なPBSとEDTAで腹膜液サンプルを洗浄します。ペレットを10ミリリットルの新鮮なPBSとEDTAに注ぎ、追加の洗浄を行い、細胞を磁気活性化細胞選別(MACS)バッファー濃度60マイクロメートルあたり1倍10〜7番目の細胞に希釈します。

20マイクロリットルのFcブロックで摂氏4度で10分間非特異的結合をブロックし、続いて20マイクロリットルの抗CD66b磁気ビーズを追加します。摂氏4度で10分間後、細胞を洗浄して500マイクロリットルのMACSバッファーに再懸濁し、適切な磁気分離器の磁場内の適切なサイズの磁気柱に細胞を加えます。すべてのCD66b陰性細胞がカラムを通過したら、15ミリリットルの新鮮なMACSバッファーをカラムリザーバーに加え、カラムを磁気分離器から新しい円錐形チューブに移します。次に、すぐにカラムを突っ込んで、磁気標識されたCD66b陽性をチューブに洗い流します。

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.