好中球細胞外トラップまたはNETの経時蛍光顕微鏡法:がん細胞とNETとの間の接着後相互作用を分析する技術

がんなどの病的状態では、活性化された好中球は好中球細胞外トラップ(NET)を放出します(ヒストンとタンパク質分解酵素に関連する細胞外DNA線維のネットワーク)。これらの構造はがん細胞を閉じ込め、がん転移に重要な役割を果たします。

NET に閉じ込められたがん細胞の接着後の挙動を in vitro で研究するには、まず、細胞の付着を促進するポリマーでコーティングされた培養皿で低密度好中球 (好中球亜集団) を培養します。インキュベートして好中球を活性化し、メッシュ状のNETを放出します。

次に、膜不透過性の緑色蛍光核色素を添加して、NETのDNA線維を特異的に染色します。使用済み培地を取り除きます。好中球培養物にがん細胞の懸濁液を加えます。

がん細胞とNETの相互作用を促進するために、培養物を短期間インキュベートします。NET の DNA 成分は、がん細胞の遊走を刺激し、NET への接着を助ける走化性因子として機能します。

使用済み培地を取り除きます。培養物を適切な新鮮な培地で優しくすすぎ、培養皿から結合していないがん細胞を取り除きます。新鮮な美容液含有培地を補充します。

タイムラプスビデオ顕微鏡を使用して培養物を長時間画像化し、NETとがん細胞の間の相互作用イベントを分析します。時間が経つにつれて、NET はがん細胞の増殖を促進する適切な微小環境を提供します。適切なソフトウェアを使用して、緑色蛍光NET上のがん細胞の増殖を観察します。

実証されているように、35 ミリメートルのディッシュ、ポリ-L-リジンコーティングディッシュで腹膜低密度好中球を培養して染色し、続いて 0.1% BSA と RPMI 1640 の 2 ミリリットルで短時間洗浄します。

培地を、BSAを添加した2ミリリットルのRPMIに懸濁した10〜6番目の未染色胃腫瘍細胞に1回交換し、室温で5分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、BSAを添加した2ミリリットルの新鮮なRPMIで細胞を室温で5分間すすぎ、その後、穏やかに旋回して付着していない腫瘍細胞を除去します。

次に、上清をFBSと抗生物質を添加したDMEMに置き換え、NETによる腫瘍細胞トラップのタイムラプス分析のために、全体像細胞観察システムに皿を取り付けます。