Lamina propria単核細胞単離:マウス結腸から単核細胞を得るためのシリカベースの密度勾配遠心分離技術

腸上皮の下に位置する腸固有層は、線維芽細胞、リンパ球や単球を含む単核細胞などの多様な細胞を含むコラーゲン線維の密なネットワークとともに、緩い結合組織で構成されています。これらの細胞は恒常性の維持に重要な役割を果たします。

単核細胞を単離するには、マウスの結腸断片を採取することから始めます。断片をコラゲナーゼ酵素を含む消化バッファーで処理します。コラゲナーゼ酵素は組織内のコラーゲン線維を消化し、細胞を懸濁液に放出します。

上清を回収し、細胞ストレーナーでろ過して未消化の組織や破片を除去し、単一細胞懸濁液を得る。濾液に冷却した緩衝液を加えて、コラゲナーゼ酵素を不活性化します。

遠心分離して細胞を分離します。酵素を含む上清を廃棄し、細胞ペレットを低密度シリカベースの分離培地に再懸濁します。次に、高密度シリカベースの分離培地の上に懸濁液を層状に重ねて、分離勾配を作成します。

混合物を遠心分離します。単核細胞は沈降し、密度勾配層間の界面に白い層を形成します。白い界面層を適切なバッファーを含む新しいチューブに慎重に移します。

心分離して精製した単核細胞を含むペレットを得る。ペレットをバッファーに再懸濁して、さらに下流の分析を行います。

まず、洗浄した結腸断片を含むチューブに20ミリリットルのコラゲナーゼ消化バッファーを加えます。チューブを密封し、摂氏37度のオービタルシェーカーに2 x gの回転速度で60分間置きます。撹拌中に組織片が一定に動いていることを確認してください。

5 ミリリットルの 66% シリカベースの密度分離培地を 3 本の別々の 15 ミリリットルのポリプロピレンチューブのそれぞれに注ぎます。次に、25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、コラゲナーゼ消化1から上清のみを収集します。きれいな50ミリリットルのポリプロピレン円錐形チューブに入れられた40マイクロリットルの細孔ろ過布製セルストレーナーを通して上清をろ過します。チューブに冷やした結腸緩衝液を完全に充填して、コラゲナーゼ消化緩衝液を急冷します。次に、細胞を回転させ、上清を吸引し、ペレットを氷上に保ちます。

テキストプロトコルで概説されているように、コラゲナーゼ消化2の実行を続行します。コラゲナーゼ消化2が完了したら、18Gの鈍い端の針を通して、チューブと10ミリリットルのシリンジの間を組織片を激しく前後に激しく洗い流します。このフラッシュを少なくとも7〜8回繰り返し、肉眼的な組織の破片や破片が見えなくなるまで続けます。

次に、組織分解懸濁液を、清潔な50ミリリットルのポリプロピレンチューブに入れた40マイクロメートルの細孔ろ過布セルストレーナーに通します。チューブをリムまで冷やした結腸緩衝液で満たして消化を急冷し、800 x g で摂氏4度で5分間遠心分離します。

真空吸引によって上清を廃棄し、再懸濁したペレットをコラゲナーゼ消化1から対応するチューブに引き出します。この後、各ペレットを結腸あたり24ミリリットルの44%シリカベースの密度分離培地に再懸濁します。10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、66%シリカベースの密度分離培地を含む3本のチューブのそれぞれに8ミリリットルのこの培地をゆっくりと層状に重ねます。

重量計または天びんを使用して、遠心分離バケット内のチューブのバランスを慎重に調整します。859 x g で摂氏 20 度で休憩せずに 20 分間遠心分離します。チューブを取り外す前に、勾配界面でセルを破壊しないように注意しながら、ローターを完全に静止させます。

通常、厚さ1〜2ミリメートルの白いバンドが存在する5ミリリットルマーク付近の勾配界面を視覚化します。真空吸引してグラジエントの上部 7 ミリリットルを廃棄し、ピペットが界面に簡単にアクセスできるようにします。連続的な手動吸引と安定した回転手首の動きを使用して、細胞の界面層を収集します。2つの勾配間の界面が明確で屈折性になるまで収集し、界面を新しい50ミリリットルのポリプロピレン円錐形チューブに移します。