胃底腺の分離:ヒトの胃組織から眼底腺を分離する方法

人間では、眼底は胃の最上部です。胃底上皮は、消化を助ける胃液を分泌する多数の胃腺で構成されています。

胃底腺を分離するには、まずヒト胃底組織をビーカーに入れます。ビーカーに適切な緩衝液を加え、胃底組織を激しく洗浄します。洗浄により、胃底組織から汚染された破片や血液が除去されます。

きれいな組織をペトリプレートに移します。滅菌ガーゼを使用して、保護粘液層を拭き取り、下にある上皮層を露出させます。鉗子を使用して、組織から最上部の上皮層を強制的にこすります。

削り取った上皮を別のペトリプレートに移し、細かく刻みます。みじん切りにした部分を、コラゲナーゼ酵素を添加したバッファーを含むフラスコに加えます。凝集を防ぐために、一定の攪拌をしながら所望の温度でインキュベートします。

コラゲナーゼは、上皮層に存在する細胞外マトリックスタンパク質を消化し、解離した胃底腺を懸濁液に放出します。懸濁液を新しいチューブにろ過して、解離していない塊を取り除きます。

を沈殿させるために、腺濾液を氷上で邪魔されないようにしてください。細胞破片を含む上清を廃棄し、腺沈殿物を新鮮な緩衝液に再懸濁します。腺ペレットを遠心分離し、さらに使用するまで保管します。

まず、準備した組織をカルシウム/マグネシウムを含まないDPBSで満たされた大きなプラスチック容器に集めます。プラスチック容器は使用するまで氷の上に置いておきます。次に、鉗子を使用して、100ミリリットルのカルシウム/マグネシウムを含まないDPBSを含む滅菌ビーカーで組織を約30秒間激しく洗浄します。次に、滅菌ガーゼを使用して上皮から粘液層を拭き取ります。

次に、大きな鉗子を使用して組織の筋肉層をしっかりと保持します。次に、大きな湾曲した止血鉗子を使用して、上皮を力でこすります。削り取った上皮を滅菌ポリスチレンペトリ皿に保管します。組織の消化を最適化するには、上皮組織を断片に細かく刻みます。次に、抗生物質を添加したカルシウム/マグネシウムを含まないDPBSで組織を洗浄します。

血液を取り除くために何度も洗います。洗浄液は廃ビーカーに捨ててください。次に、洗浄した上皮断片を、25ミリリットルの撹拌バーと予熱したインキュベーション培地を備えた125ミリリットルのガラス丸底フラスコに集めます。組織片を集めた後、丸底フラスコをゴム製セプタムで密封します。次に、20Gの脊髄針を中隔に挿入します。セプタムをゴムホースで酸素タンクに接続します。

15本の流出針を中隔に挿入して破裂を防ぎ、クランプを使用してセットアップをリングスタンドに固定します。次に、酸素流出を低くオンにします。この後、撹拌プレートで摂氏37度のウォーターバスを30〜45分間校正します。校正が完了したら、セットアップをウォーターバスに入れます。15分間のインキュベーション後、解離した腺がないか確認します。

所望のインキュベーション時間の後、血清学的ピペットを使用して50ミリリットルの予熱したDMEM / F-12をインキュベーション培地に加えます。次に、4本の50ミリリットルの円錐形チューブで滅菌ガーゼを通して得られた腺混合物をろ過します。次に、濾液を氷上で15分間インキュベートします。これにより、グランドが円錐形のチューブの底に落ち着くようになります。血清学的ピペットを使用して、腺懸濁液の上部から40ミリリットルの上清を捨てます。

残りの10ミリリットルの腺混合物を、抗生物質を添加した10ミリリットルのDPBSに再懸濁します。次に、混合物全体を 5 ミリリットルの細胞培養試験管に分配します。チューブを摂氏4度で5分間、65 x g で遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に取り除きます。