ニワトリCAMからの転移性がん細胞コロニーの単離:殻なし卵培養物からがん細胞を単離する手順

ニワトリ絨毛尿膜(CAM)は、卵殻のすぐ下にある三層膜です。それは、外側の外胚葉、血管の多い中胚葉、および最も内側の内胚葉で構成されています。

CAM中胚葉は、血管、線維芽細胞、および間質成分で構成されているため、腫瘍細胞のコロニー形成に好ましい環境を提供します。

CAMからコロニー形成されたがん細胞を単離するには、まず、蛍光標識されたがん細胞を事前に注入した殻のない卵培養物を皿に取ります。蛍光顕微鏡で卵培養を視覚化します。蛍光およびコンパクトな転移性癌コロニーを見つけます。

目的の転移性コロニーを含むCAM組織を穏やかに切除します。切除したCAM組織を微量遠心チューブに移します。組織を細かく刻んで、CAMを後続のステップで酵素治療に利用できるようにします。

チューブにコラゲナーゼ酵素を補充し、インキュベートします。コラゲナーゼはCAM中胚葉のコラーゲン蛋白質を分解し、癌コロニー解離を開始する懸濁液を遠心分離して、がん細胞、CAM組織の残骸、およびCAM線維芽細胞をペレット化します。コラゲナーゼ含有上清を廃棄します。

選択的増殖培地を加え、懸濁液を新鮮な培養プレートに移します。この培地は、他の細胞よりも浮遊がん細胞の増殖を促進します。がん細胞を吸引し、さらなる下流分析のために保存します。

注射後5日目に、胚をインキュベーターから取り出し、転移性コロニー分布について胚CAMを検査して位置を特定します。解剖顕微鏡下で、目的の転移コロニーを含むCAM組織を細い鉗子を使用して上向きにそっと引っ張り、手術用ハサミで切り取ります。

CAM組織を空の滅菌1.5ミリリットルチューブに移し、チューブの蓋を閉じます。目的のすべてのコロニーが別々のチューブに集められるまで、切除手順を繰り返します。コロニーごとに個別の滅菌18G針を使用して、微量遠心チューブでCAM組織を穏やかにみじん切りにします。100マイクロリットルの1xコラゲナーゼ溶液を加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。

細胞とCAM組織を300 x g で周囲温度で5分間スピンダウンします。コラゲナーゼ溶液を吸引し、目的の細胞株の完全培地に細胞を再懸濁します。次に、細胞と組織を再度回転させます。

細胞および組織片を1ミリリットルの完全培地と選択因子(ある場合)に再懸濁します。次に、単一の12ウェル組織培養皿ウェルに移します。次の1〜3週間は、がん細胞の増殖と汚染を毎日監視します。細胞が70%から80%のコンフルエンシーに達したら、それらをより大きな容量の培養皿に移します。適切ながん細胞数に達したらすぐに配列決定または次の選択ラウンドに進みます。