マウス舌上皮細胞の単離と培養:マウスモデルから舌上皮細胞を単離および培養する手順

舌は、層状扁平上皮と、固有層と呼ばれる緻密な結合組織の下層を構成します。上皮は、機械的ストレスから保護する多層扁平上皮細胞で構成されています。

上皮細胞を単離するには、採取したばかりのマウスの舌から始めます。舌をみじん切りにして、より小さな組織片を取得します。次に、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ酵素を含むカスタマイズされた消化カクテルで断片を処理します。

コラゲナーゼ酵素とヒアルロニダーゼ酵素は、組織を結合する細胞外マトリックスを消化し、個々の細胞の懸濁液への放出を促進します。デオキシリボヌクレアーゼは、溶解した細胞から放出された遊離DNAを分解します。

消化されたサンプルに血清含有バッファーを加えて、タンパク質加水分解酵素を不活性化します。次に、サンプルを細胞ストレーナーでろ過して、未消化の組織断片や破片を除去し、上皮細胞の単一細胞懸濁液を取得します。

遠心分離して細胞を分離します。消化混合物を含む上清を廃棄します。細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。最後に、所望の量のこの細胞懸濁液を滅菌培養皿に移します。培養物をインキュベートします。

上皮細胞は培養皿の底面に付着します。個々の上皮細胞の増殖能力に応じて、コロニーを形成し始めます。

まず、手術用ハサミを使用して、生後6週間のオスまたはメスのB6トランスジェニックマウスから舌を採取します。メスを使用して組織を非常に小さな断片に刻み、血清を含まない4.5ミリリットルのRPMIプレーン培地を含む15ミリリットルのチューブに部分を集めます。200マイクロリットルのトリプル酵素混合物をチューブに加え、サンプルを摂氏37度で30分間インキュベートし、10分ごとにチューブを軽くたたいて組織の酵素解離を促進します。インキュベーションの最後に、PBS中の5%FBSで反応を停止し、70マイクロメートルのメッシュストレーナーで細胞懸濁液をろ過して、細胞をより大きな組織断片から分離します。

遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを3ミリリットルの完全培地に再懸濁します。次に、60ミリメートルの皿あたり3ミリリットルの完全培地に細胞をプレートします。フィルターの上に保持された細胞凝集体を別の60ミリメートルの培養皿に移し、3ミリリットルの完全培地を加えます。異なる細胞コロニーが形成されるまで、両方の皿をインキュベーターに保管します。