0 閲覧数 • 3:53 分 • April 30th, 2023
ホルマリン固定パラフィン包埋またはFFPE組織切片の前処理は、核酸の曝露を促進し、その後のin situハイブリダイゼーション中に標識プローブを標的配列に結合させることができます。さらに、前処理は、細胞内の核酸の完全性と組織全体の形態を維持するのに役立ちます。
まず、目的の脱パラフィンおよび再水和されたFFPE組織切片を運ぶスライドガラスを取ります。適切な濃度の過酸化水素で組織を処理し、インキュベートします。
過酸化水素は、細胞内に生理学的に存在する内因性ペルオキシダーゼを不可逆的に不活性化します。このブロッキングプロセスにより、後続のハイブリダイゼーションステップ中に非特異的なバックグラウンドシグナルが発生する可能性が排除されます。
次に、組織切片を適切な抗原回収バッファーを含む加熱浴に浸します。所望の期間インキュベートします。高温では、タンパク質と核酸の固定剤によって誘導される化学架橋が切断され、その後の標識中にマスクされていないエピトープがプローブにさらされます。
最後に、検体を適切なプロテアーゼ溶液で処理します。湿度管理された環境下でインキュベートします。プロテアーゼはRNAのアクセシビリティを高め、特定のプローブが次のハイブリダイゼーションステップで標的配列に到達することを容易にします。
セクションを水で洗浄して、残留プロテアーゼを除去します。RNA発色in situハイブリダイゼーションには、前処理された組織切片を使用します。
事前に脱パラフィン処理してスライドラックに置いた組織切片を含むスライドのペルオキシダーゼ活性をブロックするには、サンプルを覆うのに十分な過酸化水素を各スライドに4〜6滴加え、室温で10分間インキュベートします。スライドを室温の蒸留水で2分間2回洗浄します。RNA組織の境界と組織切片を壊すには、まず、爪を使用して沸騰したTRR1xからアルミホイルを取り出し、攪拌を停止します。
スライドラックをゆっくりと慎重に浸します。ビーカーを再びアルミホイルで覆い、15分間インキュベートします。爪を使用して、すぐにホットスライドラックを蒸留水浴に移し、2分間洗浄します。次に、スライドを新鮮な100%エタノールで2分間洗浄し、室温で2分間乾燥させます。
次に、疎水性バリアペンを使用して各サンプルの周囲にバリアを描き、少なくとも5分間乾燥させます。プロテアーゼ消化の場合は、スライドを湿度制御トレイに入れ、サンプルごとに約4滴のプロテアーゼプラスを加えます。トレイに蓋をして、摂氏40度で30分間ハイブリダイゼーションオーブンに挿入します。
オーブンからトレイを取り外し、スライドラックを取り外します。一度に1枚のスライドを作業し、余分な液体をすばやく取り除き、蒸留水で満たされた染色皿に沈めたスライドラックにスライドを置きます。スライドを室温の蒸留水で2分間、一定の攪拌で2回洗浄します。