RNA CISH シグナル検出:無傷組織標本における RNA In Situ ハイブリダイゼーション中の発色シグナル検出技術

RNAハイブリダイゼーション中に発色シグナルを検出するには、まずスライドガラス上で組織切片を採取します。このセクションには、西洋わさびペルオキシダーゼ標識RNAプローブと事前にハイブリダイズされた標的RNAが含まれています。

検出基質であるジアミノベンジジンまたはDABを組織切片に数滴分注し、インキュベートします。

DABが細胞に入り、西洋わさびペルオキシダーゼ酵素が細胞を酸化して茶色の沈殿物を形成します。この反応により、細胞内の特定のRNA配列に茶色が与えられます。標的RNAを含まない細胞はペルオキシダーゼ活性を持たず、染色されないままになります。

次に、組織切片をヘマトキシリンで対比染色します。ヘマトキシリンはDNAに結合し、組織切片に紫色の染色

を与えます。

組織切片をアンモニア水 - 青めた溶液で処理します。紫色の染みの強度を下げ、細胞を青く見せます。このステップは、細胞内の茶色の斑点を明確に視覚化するために不可欠です。

次に、組織切片を濃度を上げたエタノールに浸し、続いてキシレン - 有機溶媒で処理します。これらのステップにより、組織切片が脱水され、より良い画像が得られます。

最後に、スライドを取り付け液とカバーガラスで密封し、光学顕微鏡で視覚化します。細胞は、標的RNAの存在を示す点状の茶色の点を示します。

適切なサイズのチューブに各DAB-AおよびDAB-B溶液を同じ数滴ずつ分注し、セクションごとに約120マイクロリットルのDAB基質を造り、ボルテックスします。スライドラックから各スライドを一度に1枚ずつ取り出し、タップしてフリックして余分な液体を取り除き、スライドラックに戻します。約120マイクロリットルのDAB混合物を各組織切片にピペットで移動し、切片が覆われていることを確認します。室温で10分間インキュベートし、対比染色を進めます。

ガラススラットごとに1滴の封入剤を置き、スラットをスライドの上に置き、自然乾燥させます。数時間後、原稿に記載されているように光学顕微鏡を使用して評価を進めます。