0 閲覧数 • 2:59 分 • April 30th, 2023
スフェロイドは、in vivo 腫瘍微小環境を模倣し、腫瘍の進行の研究に役立つ 3 次元の in vitro 球状細胞凝集体です。これらのスフェロイドを埋め込むことによって保存するには、まずスフェロイドを含む滅菌チューブを目的のバッファーに取ります。
スフェロイドをパラホルムアルデヒドで処理します。パラホルムアルデヒドは細胞タンパク質を架橋し、細胞構造を安定化および保存します。スフェロイドを遠心分離し、パラホルムアルデヒド含有上清を除去します。スフェロイドペレットをバッファーに再懸濁します。
次に、所望の濃度の溶融アガロースゲル溶液を調製します。顕微鏡スライドにアガロースゲル滴を作ります。アガロースの固化を避けるために、スライドを加熱ブロックに維持します。
オリフィス先端の広いマイクロピペットを使用して、チューブからスフェロイドを収集します。顕微鏡スライドに触れずに、スフェロイドをアガロースゲルドロップの中心に慎重にピペットで入れます。続いて、スライドを適切な温度でインキュベートして、ECMが固化してスフェロイドを内部に閉じ込めます。
顕微鏡スライドから半固体滴を組織カセットにそっと移します。埋め込まれたスフェロイドは、さらに下流の分析までエタノールに保存します。
まず、テキストプロトコルに概説されているように、初日にスフェロイドをヒュームフードに固定します。2日目に、アガロースゲルを電子レンジの水を入れたビーカーに入れて加熱し、必要に応じて摂氏60度に設定した卓上加熱プレートでゲルを温めます。
スフェロイドをヒュームフードで2回洗浄し、洗浄ごとに1ミリリットルの氷冷1X PBSを使用して洗浄します。次に、PBSの大部分を吸引します。20マイクロリットルのピペットチップを傾斜で切断して準備し、より大きな穴のある尖ったチップを取得します。
この後、顕微鏡スライドにアガロースゲル滴を作ります。アガロースが固まらないように、スライドを暖かい加熱ブロックの上に置きます。変更されたピペットチップを使用して、15〜20マイクロリットルの容量でできるだけ多くのスフェロイドをキャッチします。
顕微鏡スライドに触れないように注意しながら、スフェロイドをアガロースゲルドロップの中心に慎重に注入します。室温または4度で5〜10分間インキュベートして、アガロースゲルドロップを硬化させます。ゲルドロップがやや固まったが、まだかなり柔らかい場合は、メスを使用して顕微鏡スライドからプラスチック製のティッシュカセットに慎重に押し込みます。組織カセットをエタノールで満たされたビーカーに移し、室温で保存します。