マウスモデルからの細胞外マトリックスの作製:マウス舌から脱細胞化舌細胞外マトリックスを調製するための効果的な手順

細胞外マトリックスまたはECM(組織環境の非細胞成分)は、細胞によって分泌される構造タンパク質と調節タンパク質と多糖類の複雑なネットワークで構成されています。ECM は細胞に構造的および生化学的サポートを提供し、細胞の成長を調節します。

舌の細胞外マトリックスを準備するには、収穫したばかりのマウスの舌を採取することから始めます。エタノールで洗浄して脂質層を取り除きます。

次に、凍結と解凍を交互に繰り返す。.凍結は細胞内の氷結晶の形成を促進し、解凍は氷の結晶を溶かし、その結果、細胞膜が

次に、細菌の増殖を抑制するために、抗生物質溶液に舌を懸濁します。その後、臓器を高張生理食塩水で治療します。溶質濃度が高いと、細胞から水が流出し、細胞が収縮します。このステップは、細胞死と細胞外マトリックスからの剥離を助けます。

非イオン性界面活性剤で舌をインキュベートします。界面活性剤は細胞膜と核膜を完全に可溶化し、細胞内内容物の溶液への放出を促進します。

最後に、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含む溶液に舌を懸濁し、その後ヌクレアーゼ処理を行います。カルシウムイオンとマグネシウムイオンはヌクレアーゼの活性を高め、溶液中の遊離核酸を分解します。

脱細胞化した舌組織は、さらなる処理まで適切なバッファーに保管します。

テキストプロトコルに従って安楽死させたマウスから舌を単離した後、組織を75%エタノールに3分間浸漬します。次に、各舌を1.5ミリリットルの10ミリモル滅菌PBSを入れた10ミリリットルの微量遠心チューブに移します。細胞溶解を行うには、舌を摂氏マイナス80度で1時間凍結します。次に、組織を室温で45分間解凍します。凍結融解をさらに2回繰り返します。

次に、75%エタノールを含む3.5センチメートルまたは6センチメートルの培養皿で、手術用針を使用して各舌を外科用縫合糸にロードし、滅菌錫箔の小片で縫合糸の端を包みます。3.5センチメートルまたは6センチメートルの培養皿で、3ミリリットルのPBSを使用して各舌を30秒間すすぎます。次に、広口ボトルに、250ミリリットルの滅菌超純水にアンピシリン1ミリリットルあたり90マイクログラムを調製し、攪拌棒を追加します。

最大5本の舌を底から約2センチメートルになるまでボトルに下げ、縫合糸の一部がボトルの外側に残った状態でキャップを締めます。ボトルをマグネチックスターラーに12時間置きます。次に、インキュベーション後、アンピシリン1ミリリットルあたり90マイクログラムの250ミリリットルを滅菌1モル塩化ナトリウムで調製します。舌と攪拌棒をボトルに移し、キャップをねじ込みます。ボトルをマグネチックスターラーに24時間置きます。

細胞溶解を実行するには、PBS中の滅菌2%Triton X-100250ミリリットルにアンピシリン1ミリリットルあたり90マイクログラムを調製します。タンと撹拌棒をボトルに移し、キャップを締めます。次に、ボトルを48時間かき混ぜます。アンピシリンで塩化カルシウムと塩化マグネシウムを調製した後、ティッシュと撹拌棒をボトルに移動し、ボトルを24時間撹拌します。

微量遠心チューブにHBSS中の300マイクロモルDNase 1ミリリットルを調製します。縫合糸の同じ部分を外側にぶら下げた状態で、舌をチューブに移します。次に、組織を摂氏37度で24時間インキュベートします。サンプルをアンピシリンを含む滅菌PBSの広口ボトルに戻し、スターラーに24時間置きます。インキュベーション後、調製した舌細胞外マトリックス(TEM)を、使用するまで摂氏4度の滅菌PBSに保存します。