ECM懸濁液調製:組織由来細胞外マトリックスから均質な懸濁液を得る技術

細胞外マトリックスまたはECMは、組織内の複雑なサポートネットワークであり、プロテオグリカンとタンパク質で構成されています。

均質化されたECMを得るには、まず測定量の脱細胞化ECM粉末をチューブに取ります。次に、酸性化バッファーをチューブに追加してECM懸濁液を形成します。

同時に、別のチューブで、解糖酵素であるα-アミラーゼを同じ酸性化緩衝液に溶解します。この緩衝液の酸性pHは、α-アミラーゼ酵素の最適な活性を促進します。

次に、ECM懸濁液を含むチューブにα-アミラーゼ酵素溶液を補充します。一定の攪拌でチューブをインキュベートします。α-アミラーゼは、プロテオグリカンに存在する糖鎖(炭水化物部分)を加水分解します。

遠

心分離してタンパク質が豊富なECM画分をペレット化し、消化された糖鎖と使用済み酵素を上清に残します。上清を捨てます。

ペレットを塩化ナトリウム溶液に再懸濁します。塩化物イオンは、ECMペレットから懸濁液にタンパク質を抽出します。塩化ナトリウム含有上清を遠心分離して廃棄します。

次に、タンパク質を含むECMペレットに酢酸を加えます。酢酸はECMタンパク質凝集体をさらに可溶化し、懸濁させます。

ホモジナイザーを使用して、均一なECM懸濁液を得る。均質なECM懸濁液を4°Cで保存し、さらなる下流分析を行います。

みじん切りまたはクライオミルしたECMを250ミリグラム計量し、15ミリリットルの遠心分離管に移します。5ミリリットルの0.22モルNaH₂PO₄バッファーを遠心分離管に加え、チューブに液面をマークします。次に、7.5ミリグラムのα-アミラーゼを1ミリリットルの0.22モルNaH₂PO₄緩衝液に添加することにより、α-アミラーゼ原液を調製します。

次に、100マイクロリットルのα-アミラーゼ原液をサンプルに加えます。次に、0.22モルのNaH₂PO₄を加えて、10ミリリットルの最終体積を得る。懸濁液を300rpm、室温で72時間連続的に撹拌します。

懸濁液を1,500 x g で10分間遠心分離します。消化されたECMペレットを乱すことなく、上清を慎重に収集して廃棄します。次に、二重蒸留水で希釈した 10 ミリリットルの 5% NaCl を使用してペレット材料を再懸濁し、300 rpm で 10 分間連続撹拌します。

さらに2回洗浄を繰り返してから、10ミリリットルの二重蒸留水を使用してペレットを再懸濁します。次に、懸濁液を室温で300rpmで10分間連続的に撹拌します。サンプルを再度遠心分離した後、消化されたECMペレットを乱すことなく、上清を慎重に収集して廃棄します。

5ミリリットルのマークに0.2モル酢酸を加えてボルテックスします。次に、サスペンションを120rpm、摂氏37度で一晩攪拌し続けます。翌日、幅10mmの鋸歯プローブを