JoVE 実験百科事典
がん研究
0 回視聴 • 4:13 分 • April 30th, 2023
マイクロキャリアは、細胞の付着と増殖のための広大な表面を提供する相互接続された細孔を備えたミクロンサイズの球状支持マトリックスです。
細胞外マトリックスまたはECM由来のマイクロキャリアを作製するには、微粉末のECMの均一な懸濁液から始めます。輸液セットに接続された注射器に懸濁液をロードします。シリンジをシリンジポンプに固定します。極低温フラスコの上に適切な距離で針を垂直に置きます。
次に、針を高電圧電源のプラス端子に接続します。折りたたんだアルミホイルストリップをフラスコの端に取り付け、接地端子に接続して回路を完成させます。
次に、アルミストリップの内側の端を沈めた状態でフラスコに液体窒素を入れます。必要な電圧を印加し、シリンジポンプを適切な流量に設定してエレクトロスプレーを開始します。導電性 ECM 懸濁液が針先から出てくると、電界と表面張力の影響でその形状が変形し、先のとがった液体円錐形が形成されます。
電圧が増分すると、サスペンションが噴出します。これは最終的に帯電した小さな液滴に分解され、液体窒素浴に落ちます。液体窒素は微小液滴を瞬時に凍結させ、内部の溶媒粒子を結晶化させます。
凍結した微小液滴を新しいチューブに移します。サンプルを凍結乾燥します。このステップは、サンプルから凍結した溶媒粒子を除去し、その場所に細孔を生成するのに役立ちます。多孔質マイクロキャリアの乾燥粉末は、さらなる用途のために保管してください。
クライオミルしたECM懸濁液を100 rpmで連続撹拌して一晩インキュベートします。3ミリリットルのECM懸濁液を3ミリリットルのルアーロックシリンジにロードし、シリンジのボアに翼のある輸液セットを取り付けます。シリンジポンプ内にシリンジを固定します。次に、針をレトルトスタンドに固定し、針先をローフォームのデュワーフラスコの上部から4〜6センチメートルの距離に垂直に配置します。
次に、ワニ口クリップ電極を針の先端に取り付け、ワニ口クリップが高電圧電源のプラス端子に接続されていることを確認します。アルミホイルのストリップを魔法瓶の端に折ります。次に、2番目のワニ口クリップ電極をホイルの外縁に取り付けます。電源のアースソース端子に接続します。
デュワーフラスコに液体窒素を上部から約1センチメートルまで満たし、ホイルの4分の3が水没するようにします。次に、シリンジポンプを毎時30ミリリットルの注入速度に設定し、テキストプロトコルに従ってサンプルをエレクトロスプレーします。注入が完了したら、デュワーから余分な液体窒素を慎重に注ぎ、マイクロキャリアを約 25 ミリリットルの液体窒素に浮遊させて凍結したまま
にします。液体窒素を含むマイクロキャリアを、1回のスムーズな動きで注ぎ、50ミリリットルの遠心分離管にすぐに移します。次に、スクープラを使用して、デュワーに残っている凍結マイクロキャリアを収集します。それらを遠心分離管に加えます。凍結乾燥の準備をするには、遠心分離管を小さな穴の開いたアルミホイルで覆います。蓋をした遠心分離管を凍結乾燥フラスコに入れます。次に、すぐにフラスコを凍結乾燥機に接続し、サンプルを一晩乾燥させます。