0 閲覧数 • 4:55 分 • April 30th, 2023
神経周囲浸潤またはPNIとは、神経に沿ったがん細胞の移動と、その後の神経周囲への浸潤を指します。
in vitroでPNIを模倣するには、まず細胞外マトリックスまたはECM懸濁液を培養皿に一滴加えて、半球の形になるようにします。次に、培養皿をインキュベートして、3D足場の構造的および機能的特徴を強化します。
次に、事前に採取した後根神経節または感覚ニューロンのクラスターであるDRGを、半固体ECM液滴の中心に慎重に配置します。インキュベートして DRG を ECM 液滴内に埋め込みます。
その後、適切な増殖培地を加えてインキュベートします。栄養素が補給されたECMは、DRGが神経突起と呼ばれる小さな神経突起に発芽し、液滴の周囲に向かって放射状に成長します。
使用済み培地を取り除き、その後のアッセイのためにECM液滴を調製します。液滴の上に付着がん細胞を蛍光染色したシード。半球形のため、がん細胞は転がり、液滴の周囲に沿って定着します。
培養皿をインキュベートして、がん細胞と神経突起の相互作用を可能にします。蛍光顕微鏡で見ると、がん細胞が神経突起に沿って追跡し、DRGに向かって移動していることがわかり、神経周囲浸潤が確認されます。
半固体マトリックス液滴を調製するには、1つのガラスウェル底プレートを氷から手術顕微鏡下で氷ブロックに移します。10マイクロリットル以下のピペットの先端を45度の角度でガラスに直接置き、1.5マイクロリットルのマトリックス液滴をガラスに慎重に分注します。マトリックスがプレートにかみ合ったら、ピペットチップをガラスからゆっくりと離します。
プレートの四隅のそれぞれにマトリックスの液滴を1滴ずつ堆積させ、プレートを室温の表面に約1分間移します。マトリックスがわずかに固まったら、プレートをアイスブロックに戻し、閉じた顕微鏡鉗子を使用して、左手でDRGをそっとすくい取ります。
右手を使用して、神経組織を21G針の先端に慎重に移し、針を使用してDRGをマトリックス液滴の中央にそっと挿入します。DRGは、針で中央に位置決めするためにマトリックスに簡単に解放されるはずです。
DRG片を4つの液滴のそれぞれに挿入した後、プレートを摂氏37度のインキュベーターに3分間入れます。すべてのDRGが埋め込まれたら、プレートを一度に1つずつわずかな角度で保持し、培地がマトリックスDRGユニットと徐々に接触するように、10%FBSを添加した4ミリリットルのDMEMをプレートにゆっくりと加えます。
プレートをインキュベーターに戻してさらに48〜72時間放置します。神経突起がマトリックスの端までの少なくとも75%に達したら、マトリックスDRGユニットを取り外さずにウェルから培地を吸引します。次に、滑らかなトリガーを備えた200マイクロリットルのピペットを使用して、培地1ミリリットルあたり5番目の細胞に3倍10の2滴を各マトリックスDRGアッセイに置き、プレートをインキュベーターに戻します。1時間後、ガラス底プレートの側壁に沿って10%FBSを含む4ミリリットルのDMEMをそっと加え、次の顕微鏡評価までプレートをインキュベーターに戻します。