0 閲覧数 • 5:22 分 • April 30th, 2023
腫瘍には、サイド集団として知られる幹細胞様細胞のごく一部が含まれています。これらの細胞は化学療法耐性があり、がんの再発の原因となります。
がん細胞の側面集団を単離するには、まず、がん細胞懸濁液を含むバイアルに蛍光色素溶液であるヘクストを加えます。正常ながん細胞内では、ヘヒスト分子が核に入り、DNAのA-Tに富む領域に結合し、これらの細胞に高い蛍光をもたらします。
対照的に、側生集団には高濃度のABCトランスポーター、つまり細胞から色素分子を急速に除去する流出ポンプが含まれています。この色素分子の活発な流出により、サイドポピュレーションは低強度で蛍光を発します。
次に、ヘヒストで処理されたがん細胞の別のバイアルを取り、それにベラパミルを加えます。このバイアルは、ベラパミルがABCトランスポーターをブロックする際のコントロールとして機能します。このステップにより、ヘクスト流出が減少し、色素が側集団細胞内に保持されます。
次に、ヨウ化プロピジウムを使用して両方のバイアルの細胞を対比染色します。ヨウ化プロピジウムは、死んだ細胞の核にのみ入り、DNA塩基の間に挿入します。これにより、死んだ細胞で高い蛍光
が発生します。最後に、蛍光活性化セルソーターまたはFACSを使用して細胞を選別します。FACSは、蛍光性が高く、ヘヒストを保持する腫瘍細胞および死細胞を、低蛍光側集団細胞から
分離します。ヘヒスト色素流出アッセイによってがん幹細胞様細胞の副集団を選択するには、まず、1つの円錐形チューブを「ヘクスト」と1つの「ヘクストとベラパミル」にラベル付けします。次に、HNSCC細胞培養物を滅菌PBSで洗浄し、続いて1ミリリットルのトリプシン-EDTAを加えます。摂氏37度で3分後、新鮮な細胞培養培地との反応を停止し、細胞をカウントします。培養物を完全な親細胞株培地で1ミリリットルあたり10〜7番目の細胞に1倍に希釈します。
次に、「Hoechst and Verapamil」チューブに100マイクロリットルを加え、「Hoechst」チューブに4ミリリットルの細胞を加えます。次に、10マイクロリットルの5ミリモル塩酸ベラパミル溶液を「ヘクストおよびベラパミル」サンプルに穏やかに混合し、続いて1×10あたり5マイクロリットルのヘクストを6番目のセルに両方のチューブに混合します。次に、サンプルをアルミホイルで覆い、摂氏37度に置きます。15分ごとに穏やかに混合して90分間後、チューブを遠心分離し、ペレットを2ミリリットルのPBSに再懸濁します。
2回目の遠心分離後、「ヘクストおよびベラパミル」ペレットをPBS中の500マイクロリットルのヨウ化プロピジウムに再懸濁し、「ヘクスト」ペレットを4ミリリットルに再懸濁します。次に、サンプルを70ミクロンのセルストレーナーを通してFACSチューブにろ過して凝集体を除去し、光から保護された氷の上にサンプルを置きます。次に、「Hoechst」サンプルをフローサイトメーターにロードし、フローサイトメーターソフトウェアで「グローバルワークシート」ウィンドウを開きます。「ドットプロット」をクリックしてグローバルワークシートにグラフを作成し、右クリックして前方散布図パラメータと横方散布図パラメータを選択します。
同じ方法で、側方散布図の高さのドットプロットで幅広の側方散布図を作成し、「ポリゴンゲート」をクリックして、2番目のグラフにP1領域を作成し、単一セルを選択し、ダブレットを識別します。次に、青い Hoechst 領域のドット プロットで赤い Hoechst 領域を作成し、セルを右クリックして P1 母集団を強調表示します。次に、P2領域を作成して、細胞のメイン集団の左側にサイドアームとして現れる細胞の負のHoechst色素側集団を選択し、「Hoechst」サンプルイベントを10,000回収集します。
側の母集団を表す P2 ゲートが正しく配置されていることを確認するには、10,000 個の「Hoechst と Verapamil」サンプル イベントも収集します。サイドの人口は消えるはずです。次に、ヘヒスト色素陰性細胞の側面集団を、1ミリリットルの完全な癌幹様細胞培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに選別します。選別の最後に、細胞をスピンダウンし、サイドポピュレーションペレットを1ミリリットルの新鮮な完全がん幹細胞様細胞培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、適切な数で新しい細胞培養フラスコに播種します。