メチルチアゾリルテトラゾリウムまたはMTTアッセイ:がん細胞の代謝活性の測定を通じて薬剤耐性を測定する比色アッセイ

メチルチアゾールテトラゾリウムまたはMTTアッセイにより、細胞代謝活性の測定に基づく細胞生存率の評価が可能になります。

アッセイを開始するには、目的の薬物の濃度の増加の範囲を準備します。マルチウェルプレートのウェルに同量の異なる薬物濃度

を加えます。

次に、所望の薬剤感受性親がん細胞とその薬剤耐性変異体の懸濁液を適切な培地にピペットで、それぞれ異なる薬物濃度を含むウェルのセットにピペットで入れます。プレートをインキュベートします。

培養では、薬剤感受性がん細胞は薬物分子に感受性があり、低濃度でも細胞死に至ります。それどころか、薬剤耐性がん細胞は薬物分子に鈍感であり、より高い薬物濃度でもそれらの生存と増殖を促進します。

細胞をMTT溶液で処理し、インキュベートします。正に帯電したテトラゾリウム塩であるMTTは、代謝活性細胞に容易に浸透します。これらの細胞内では、NAD(P)H依存性酸化還元酵素がMTT塩を水不溶性ホルマザン結晶に還元し、細胞表面に輸送します。

次に、適切な可溶化溶液をウェルに加えます。よく混ぜてホルマザン結晶を着色溶液に溶解します。最後に、マイクロプレートリーダーを使用して、細胞の代謝活性を示す着色溶液の吸光度を測定します。

薬剤耐性がん細胞を含むウェルはより高い色の強度を示し、薬剤感受性がん細胞と比較して細胞生存率が高いことを示唆しています。

96ウェルの平底実験プレートを準備します。ウェルを薬物濃度に捧げて、細胞を制御し、細胞のない培地を制御します。デキサメタゾンまたはデックスの薬物希釈範囲を準備します。各Dex希釈液から30マイクロリットルを96ウェルプレートの適切なウェルに加えます。各濃度を 3 回に分けて含めるようにしてください。

指数関数的に成長する白血病細胞を収穫し、最適な播種濃度で再懸濁します。薬物溶液または増殖培地のいずれかを含む各ウェルに120マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、摂氏37度で5%二酸化炭素とともに72時間インキュベートします。インキュベーションステップの後、繰り返しピペットを使用して、各ウェルに15マイクロリットルのMTT試薬を追加します。

プレートシェーカーでプレートを毎分最大900回振るまで5分間振ってください。プレートを摂氏37度に戻し、5%の二酸化炭素と細胞培養インキュベーターに入れ、さらに4〜6時間インキュベートします。

インキュベーション後、吸光度値は化合物の適切な可溶化に依存するため、ホルマザン結晶を完全に再懸

濁してください。

酸性化イソプロパノールを各ウェルに150マイクロリットルを加え、マルチチャンネルピペットでよく混合して、すべてのホルマザン結晶を完全に再懸濁します。マイクロプレートリーダーを使用して、540ナノメートルと720ナノメートルの光学濃度またはODを決定し、バックグラウンドODを