タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム
September 22nd, 2011
タンパク質治療薬を製造するための製造の細胞株開発のハイスループット、自動化されたプラットフォームが記載されている。 BD FACSアリアセルソーター、CloneSelectイメージャとTECAN自由EVOリキッドハンドリングシステムの実装では、改善された細胞株の品質と高い再現性を持つ細胞株の開発における有意に増加した処理能力を実証してきました。
この手順の全体的な目標は、クローン性と高い生産性を備えた生物製剤用の製造細胞株を開発することです。これは、最初に宿主細胞をDNAでトランスセクトし、目的の遺伝子をコードすることによって達成されます。手順の次のステップは、ファクトによって高産生クローンを単離し、続いてクローン選択イメージャーによるコロニー形成の文書化を行うことです。
最後のステップは、生産性の高いクローンをスクリーニングして選択することです。最終的には、逆相HPLCによる連続培養および供給バッチ培養における抗体産生を示す結果を得ることができます。ビデオ。この方法のデモンストレーションは、複雑なセットアップがこれらの手順に関与しているため、ソーティングとpcan 80 dglステップを学ぶのが難しいという事実として重要であり、研究室の次の科学者は、宿主細胞効果のトランスフェクションのためのこれらの手順を実証し、コロニー形成の文書化のためのジェイソン・サンダースとテカンサンプリングのためのラッセル・カンのソーティングを行います。
そして、エリザは、トランスフェクションの1日前にこの手順を開始するために、細胞培養フラスコ内の宿主細胞を15ミリリットルの成長で播種します。中程度。翌日に摂氏37度、二酸化炭素7.5%のインキュベーターで細胞をインキュベートし、トランスフェクション複合体を最初に8マイクログラム、800マイクロリットルの成長培地で希釈し、滅菌マイクロ遠心チューブで穏やかに混合します。次に、ポリスチレンチューブ内の血清を含まない800マイクロリットルの成長培地で40マイクロリットルの唇を希釈します。
希釈したDNAを希釈したリポフェクタミンに加えます。穏やかに混合し、室温で30分間インキュベートして、トランスフェクション用の宿主細胞を調製します。細胞から増殖培地を取り出し、血清を含まない6.4ミリリットルの増殖培地と交換します。
1.6ミリリットルのトランスフェクション複合体をフラスコに加えます。フラスコを揺らしてやさしく混ぜます。細胞を37°Cで二酸化炭素インキュベーターで6時間インキュベー
トします。6時間後、8ミリリットルの成長培地をフラスコに加え、翌日、二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。吸引によって培地を取り除き、新鮮な成長培地をフラスコに加えます。一晩インキュベーションした後、細胞を再度一晩インキュベートします。
増殖培地を選択液に置き換えます。中程度。細胞を37°Cの二酸化炭素インキュベーターで2〜3週間インキュベートします。トランスフェクション後2〜3週間で、細胞はフローサイトメトリーによるクローニングの準備が整い、フラスコから移動した細胞を活性化細胞ソーティングし、摂氏4度で5分間800RPMで遠心分離します。
細胞を選択培地に再懸濁し、2%ウシ血清アルブミンを添加します。次に、蛍光標識した抗ヒトIgG抗体を添加します。1〜20の希釈液を加え、氷上で15〜30分間インキュベートした後、冷たくPBSで2回洗浄し、ポリプロピレンチューブ内の1つのXPBSで細胞を再懸濁します。
染色された細胞の例は、BD FAXアリア上の無菌ソートのためにこの写真に示されています。各ウェルに200マイクロリットルの選択培地を含む96ウェル細胞培養プレートを準備します。チューブに細胞を無菌的にロードし、BDの事実を分析します。Ariaは、染色された細胞と未染色の細胞についてそれぞれ結果を記録します。
所望の蛍光染色プロファイルの単一細胞を96ウェルプレートにソーティングするためのゲートと設定を行い、0日目、3日目、7日目、および13日目に37°Cインキュベーターでプレートをインキュベートし、96ウェルプレートで文書コロニー形成をクローン選択イメージャー上でソーティングし、単一細胞に由来するクローンの選択を確実にし、生産性の高い選択を行います。クローン。まず、96ウェルアッセイプレートの受入サンプル位置を文書化します。次に、ロボットリキッドハンドリングシステムを使用して、20マイクロリットルの上清のアリコートを96ウェルアッセイプレートの各ウェルに移し、サンプル中の抗体産生をサンドイッチで分析します。
リキッドハンドリングシステム上のELI SAを以下のように検出するヒトIgG。まず、サンプルと標準試料を、あらかじめコード化されたバイオコート抗ヒトIgGアッセイプレートにロードします。プレートを室温で2時間インキュベートした後、PBSを3回洗浄します。
次に、免疫純粋ヤギ抗ヒトIgG。HRPを1〜2000希釈でプレートに添加し、プレートを室温で1時間インキュベートします。1時間後、プレートをPBSで3回洗浄し、次にA BTS基板を添加します。
最後に、プレートリーダー上でプレートは赤色になり、405ナノメートルの吸光度で検出されます。この自動化されたプラットフォームを用いて、蛍光標識抗ヒトIgGによる染色によって反射される表面抗体レベルが、細胞の抗体生産性と相関していることを発見しました。ここに示すように、表面抗体の発現が高い細胞集団から生成された上位2つのクローンでは、特異的生産性は1細胞あたり1日あたり50〜70ピコグラムの範囲でした。
対照的に、抗体生産性は、表面抗体発現が低い細胞集団から生成された上位2つのクローンでは、1細胞あたり1日あたり約20ピコグラムでした。さらに、ファクトソーティングによって開発された細胞株は、手動の限界希釈によってクローニングされた細胞株よりも抗体産生に関して安定しています。手動制限希釈によって生成された最上位のクローンクローンの特異的生産性は、80細胞倍増培養後、約30PCDから約10PCDに低下しました。
一方、FAX仕分けクローン2によって生成されたトップサブクローンは、少なくとも100セルの倍増に対して、約20PCDの特定の生産性を維持することができた。蛍光in situハイブリダイゼーションによる細胞染色体の導入遺伝子統合部位の同定は、クローン1が表現型Aと表現型の混合集団であることを示しました B.In 対照的に、選別されたクローンは表現型Aの細胞の99.5%でより均質な集団であるように見えました。
概要
この記事では、タンパク質治療薬を生産するための細胞株を開発するための高スループットの自動化プラットフォームについて説明しています。先進技術の実装により、細胞株開発における処理能力と再現性が大幅に向上しました。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞株開発
- タンパク質治療薬の生産
- 高スループットスクリーニング
背景
- 目標は、高いクローン性と生産性を持つ製造細胞株を開発することです。
- 目的の遺伝子をコードするDNAを宿主細胞に導入することが最初のステップです。
- フローサイトメトリーによって高い生産性を持つクローンの分離が達成されます。
- コロニー形成の記録はイメージング技術を用いて行われます。
研究の目的
- 治療用タンパク質のための細胞株を開発する自動化された方法を示すこと。
- 細胞株開発の効率性と品質を向上させること。
- 高度な分類とイメージング技術を使用することの利点を示すこと。
使用した方法
- DNAとリポフェクタミンを用いた宿主細胞のトランスフェクション。
- 高い生産性を持つクローンの分類のためのフローサイトメトリー。
- クローン選択イメージング装置を用いたコロニー形成の記録。
- ELISAによる抗体生産分析。
主要な結果
- 表面抗体レベルは抗体生産性と相関しています。
- 分類によって開発された細胞株は、手動希釈法よりも安定しています。
- クローンの特定の生産性は、分類方法によって大きく異なります。
- 蛍光in situハイブリダイゼーションは、集団の均一性に違いがあることを示しました。
結論
- 自動化プラットフォームは細胞株開発の効率性を向上させます。
- 高スループット法はより良い品質と再現性につながります。
- 分類技術は細胞株の安定性と生産性を向上させます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput, automated cell line development platforms are critical for accelerating the production of protein therapeutics in biopharma pipelines. This integrated workflow enhances predictive confidence in clone selection, reduces operator error, and supports rapid portfolio advancement. The approach directly addresses the industry's need for scalable, reproducible, and traceable manufacturing cell lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of host cell productivity and stability for biologic manufacturing.
- Supports functional validation of transgene expression and integration in production hosts.
- Facilitates mechanistic de-risking by correlating surface antibody levels with productivity.
- Improves predictive confidence in selecting high-yielding, stable clones for further development.
Screening & Assay Development
- Automates preparation and screening of thousands of clones per cycle for quantitative productivity assessment.
- Standardizes ELISA-based productivity measurements using robotic liquid handling for reproducibility.
- Enables high-throughput, fluorescence-based selection of top-producing clones via flow cytometry.
- Provides electronic documentation and traceability of clone history for compliance and reuse.
Translational & Preclinical Research
- Supports continuity from cell line selection to preclinical protein production for therapeutic candidates.
- Aligns clone selection with downstream manufacturing and analytical requirements.
- Reduces risk of late-stage failure by ensuring stability and homogeneity of production cell lines.
Pipeline & Workflow Integration
This automated platform bridges early discovery, screening, and preclinical manufacturing by integrating transfection, clone selection, and productivity analytics into a unified workflow.
- Discovery Biology: Provides quantitative, fluorescence-based readouts for hypothesis testing and clone prioritization.
- Screening: Delivers high-throughput, reproducible productivity data to inform go/no-go decisions.
- Analytics: Enables direct comparison of clone performance using ELISA and imaging outputs.
- Translational Research: Ensures selected clones meet stability and productivity thresholds for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform adaptable to various protein therapeutics and host systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in clone selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in cell line development.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by minimizing manual error.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biologic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, imaging, and automated liquid handling systems.
- Demands access to integrated instrumentation and robust analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of protocols and data management.
- Adaptable to different host cell systems and protein modalities with appropriate probe selection.
- Throughput and scalability are limited by instrumentation capacity and assay design.
