タンパク質治療薬の製造細胞株の開発のためのハイスループット自動化されたプラットフォーム

この手順の全体的な目的は、クローナリティと高い生産性を備えたバイオ医薬品製造用の細胞株を開発することです。まず、目的遺伝子をコードするDNAで宿主細胞をトランスフェクションすることでこれを達成します。手順の次のステップでは、FACTsを用いて高生産クローンを単離し、続いてCloneSelect Imagerによってコロニー形成を記録します。

最終ステップは、高生産性のクローンをスクリーニングし、選択することです。最終的に、逆相HPLCを通じて、連続培養およびフィードバッチ培養における抗体産生を示す結果を得ることができます。これらの手順には複雑なセットアップが含まれるため、ソートおよびpcan 80 dglのステップを習得することは困難であり、本手法のビデオによる実演が不可欠となります。そこで、研究室の科学者たちが、ホスト細胞へのトランスフェクション、コロニー形成の記録のためのソート（Jason Sanders）、およびTecanサンプリング（Russell Kan）の手順を実演します。

この手順を開始するには、トランスフェクションの1日前に、ホスト細胞を15 mLの増殖培地と共に細胞培養フラスコに播種します。細胞を37 °C、7.5% CO₂インキュベーターで培養します。翌日、トランスフェクション複合体を調製します。まず、8 µgのDNAを、滅菌マイクロ遠心チューブ内で800 µLの無血清増殖培地で希釈し、穏やかに混ぜ合わせます。次に、40 µLのLipofectamineを、ポリスチレンチューブ内で800 µLの無血清増殖培地で希釈します。

希釈したDNAを希釈したLipofectamineに加えます。穏やかに混ぜ合わせ、室温で30分間インキュベートして、ホスト細胞をトランスフェクションに備えさせます。細胞から増殖培地を除去し、血清を含まない増殖培地6.4 millilitersに置換します。

1.6 millilitersのトランスフェクション複合体をフラスコに加えます。フラスコを揺らして緩やかに混合します。細胞を二酸化炭素インキュベーターにて37 degrees Celsiusで6時間インキュベートします。

6時間後、フラスコに8 mLの増殖培地を加え、二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで翌日まで一晩インキュベートします。吸引により培地を除去し、新鮮な増殖培地をフラスコに加えます。一晩のインキュベーション後、さらに一晩、細胞をインキュベートします。

増殖培地を選択培地（selection Medium）に交換します。細胞を二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで2〜3週間培養します。トランスフェクションから2〜3週間後、フローサイトメトリーを用いた活性化細胞ソート（FACS）によるクローニングが可能になります。フラスコから細胞を回収し、4 °Cで800 RPMにて5分間遠心分離します。

2% 牛血清アルブミンを添加した選択培地で細胞を再懸濁します。次に、蛍光標識抗ヒトIgG抗体を加えます。1/20に希釈した抗体を加え、氷上で15〜30分間インキュベートした後、冷PBSで2回洗浄し、ポリプロピレンチューブ内で1×PBSを用いて細胞を再懸濁します。

染色された細胞の例をこの写真に示します。BD FACSAriaで無菌ソートを行うため、各ウェルに 200 µL の選択培地を含む 96ウェル細胞培養プレートを用意してください。細胞が入ったチューブを無菌的にロードし、BD FACSAriaで分析して、染色細胞と未染色細胞の結果をそれぞれ記録します。

目的の蛍光染色プロファイルを持つ単一細胞を96ウェルプレートにソートするように、ゲートおよび設定を行います。プレートを37 °Cのインキュベーターで2週間培養し、ソート後の0日目、3日目、7日目、および13日目に、クローン選択イメージャーを用いて96ウェルプレート内のコロニー形成を記録します。これにより、単一細胞由来のクローンが選択されたことを確認し、高産生クローンのスクリーニングおよび選択を行います。まず、回収用の96ウェルアッセイプレートにおけるサンプルの位置を記録します。次に、ロボット液体ハンドリングシステムを使用して、20 µLの上清を96ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注します。サンプル中の抗体産生量は、サンドイッチ法によって分析します。

リキッドハンドリングシステムを用いて、以下の方法でヒトIgG検出ELI SAを行います。まず、あらかじめコーディングされたバイオコート抗ヒトIgGアッセイプレートに、サンプルと標準物質をロードします。プレートを室温で2時間インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。

次に、immuno pure goat anti-human IgG HRPを1:2000に希釈してプレートに添加し、室温で1時間インキュベートします。1時間後、プレートをPBSで3回洗浄し、その後TMB基質を添加します。

最後に、プレートリーダーを用いて405 nanometersの吸光度でプレートを読み取ります。この自動プラットフォームを使用した結果、蛍光標識抗ヒトIgGによる染色で示される表面抗体レベルが、細胞の抗体生産性と相関することが分かりました。ここで、表面抗体発現量が高い細胞集団から得られた上位2つのクローンについて示したように、比生産性は1細胞1日あたり50 to 70 picogramsの範囲でした。

対照的に、表面抗原発現レベルの低い細胞集団から作製された上位2つのクローンの抗体生産性は、1細胞1日あたり約20 picogramsでした。さらに、FAC sortingによって開発された細胞株は、手動の限界希釈法でクローニングされた細胞株よりも、抗体生産に関して安定していました。手動の限界希釈法で作製された上位クローンであるクローン1の比生産性は、80回の細胞分裂を経て培養した後、約30 PCDから約10 PCDにまで低下しました。

一方で、FACSソートによって得られたクローン2から生成された最良のサブクローンの比生産性は、少なくとも100回の細胞分裂後も20 PCD付近で維持されました。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いて細胞染色体上の外来遺伝子挿入部位を特定したところ、クローン1は表現型Aと表現型Bの混合集団であることが示されました。対照的に、FACSソートされたクローンは、細胞の99.5%が表現型Aである、より均質な集団であると考えられました。このビデオを視聴することで、治療用タンパク質を産生するための製造用細胞株の開発方法について十分に理解できるはずです。