唾液腺組織からの唾液球の培養:ヒト唾液腺由来上皮細胞からの唾液球の開発方法

唾液球は、唾液腺に由来する上皮細胞のin vitroの自己凝集培養物です。唾液球を培養するには、まずヒト唾液腺組織を培養プレートに収めます。

さみを使って、ティッシュを細かく刻みます。次に、これらの断片にコラゲナーゼと分散酵素を含む解離溶液を補充し、インキュベートします。これらの酵素は、組織内に存在する細胞外マトリックスを消化します。

さらに、組織を均質化するために粉砕します。このステップにより、上皮細胞と赤血球が溶液中に放出されます。次に、細胞ストレーナーを使用し、組織ホモジネートを新しい円錐形のチューブにろ過して、未消化の組織片や破片を除去します。遠心分離機で細胞をペレット化します。

遠心分離後、上清を廃棄し、細胞ペレットを赤血球溶解バッファーに再懸濁します。このバッファーは、細胞懸濁液中に存在する赤血球を破裂させます。

次に、遠心分離して上皮細胞をペレット化します。ペレットを適切な上皮細胞増殖培地に再懸濁します。さらに、液化基底膜マトリックスまたはBMMでウェルをコーティングすることにより、唾液培養プレートを準備します。マトリックスが固化するまでインキュベートします。

最後に、上皮細胞懸濁液をBMMでコーティングされたウェルに加えます。増殖培地の存在下では、上皮細胞はBMM層に付着し、球形の唾液球に増殖する。

患者から取り出してから2〜4時間以内に、培養プレート上で、オートクレーブ滅菌解剖ハサミと外科用鉗子を使用して、唾液腺組織を1〜2ミリメートルのサイズの細かい断片に細かく刻みます。6ミリリットルのディスパーゼ/コラゲナーゼ溶液をみじん切りにした組織に加えます。その後、摂氏37度で約30分から1時間インキュベートします。

5ミリリットルの血清学的ピペットで15〜20回ピペッティングして組織を破壊します。摂氏37度でさらに30分から1時間インキュベートします。ピペッティングとインキュベーションのステップをさらに2〜3回繰り返すか、組織がスラリーに似てピペットの開口部を簡単に通過できるようになるまで繰り返します。

ウェルをBMMでコーティングするには、500マイクロリットルの一晩解凍したBMMを6ウェルプレートの各ウェルにゆっくりとピペットで入れます。プレートをゆっくりと回転させて、BMMをウェル全体に均等に分散させます。次に、使用前にコーティングされたプレートを摂氏37度で少なくとも15分間インキュベートし、BMMを固化させます。

均質化された組織を含むディスパーゼ/コラゲナーゼ溶液を15ミリメートルの円錐形チューブに移します。プレートの壁を6ミリリットルのDPBSで1回洗浄し、残りの細胞を円錐形のチューブに移します。次に、70マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを通して、ホモジネートを新しい50ミリメートルの円錐形チューブにろ過して、未消化の組織を除去します。

500 x gで5分間、緊張した細胞を遠心分離します。上清を吸引します。次に、細胞ペレットを10ミリリットルの1x RBC溶解バッファーに再懸濁します。摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、20〜25ミリメートルのDPBSを加えて、赤血球溶解バッファーを中和し、唾液細胞の溶解を最小限に抑えます。

500 x g で 5 分間遠心分離します。白血球ペレットは、すべての赤血球の完全な溶解を示します。ペレットが赤色になっている場合は、赤血球溶解バッファーによる処理を繰り返します。上清を吸引し、ペレットを1〜2ミリリットルのBEGMに再懸濁し、再懸濁した細胞をBMMコーティングウェルに移します。

摂氏37度でインキュベートします。BMMにプレーティングされると、細胞は2〜3日間にわたって球形構造または唾液球に形成されます。細胞は、BMMが分解し始める前に約5〜7日間唾液球として維持することができ、細胞がプラスチックにアクセスして付着し、単層として成長することができます。