細胞外DNA染色:FFPE組織切片中の細胞外DNAを同定する方法

死にかけた細胞は、細胞外DNAと呼ばれる細胞外のDNAの一部を放出します。細胞外DNAを染色するには、まずホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片をスライドガラス上で採取します。スライドガラスを所望の時間加熱します。これにより、スライド表面への組織の付着が容易になり、周囲のパラフィンが柔らかくなります。

スライドを脱パラフィン液に浸して、組織周囲のパラフィン層を完全に溶解します。次に、スライドを濃度の低いエタノールに浸して、脱パラフィン化組織を再水和します。水分補給後、スライドを沸騰した抗原回収溶液に浸します。この処理により、固定プロセス中に変化したエピトープが明らかになります。

スライドに一次抗体を重ね合わせ、細胞上に存在する特定のマスクされていないエピトープに結合させます。次に、一次抗体に結合する蛍光タグ付き二次抗体を追加します。スライドをスーダンブラック溶液に浸して、バックグラウンドの自家蛍光を減らします。

最後に、DAPIを添加した封入剤を組織切片の上に一滴置き、カバーガラスで密封します。DAPI分子がDNAを染色できるようにインキュベートします。調製した組織切片を蛍光顕微鏡で可視化します。細胞内の蛍光標識エピトープは、細胞内に存在する核DNAを細胞外DNAから区別するのに役立ちます。

細胞外DNA染色の場合、まず、スライドラック内の目的のサンプルを摂氏60度で60分間加熱してから、スライドをヒュームフード内の40分間の溶媒交換に2回浸します。2回目の浸漬後、サンプルを100%エタノールで2回、70%エタノールで1回、処理ごとに5分間再水和します。

最後の処理後、トングを使用して、スライドを沸騰した抗原回収溶液に圧力鍋で10分間強火で入れます。抗原エピトープのマスキングを解除した後、圧力鍋を熱からシンクに移し、すぐに冷たい水道水を蓋の上に流します。

スライドを抗原回収液中で20分間平衡化させてから、サンプルをオービタルシェーカー上の0.01モルPBSで5分間洗浄1回2回洗浄します。2回目の洗浄後、疎水性ペンを使用して腎臓組織サンプルの周りに円を描き、室温で30分間、5%ウシ血清アルブミン中の60マイクロリットルの10%鶏血清で非特異的染色をブロックします。

インキュベーションの最後に、ブロッキング溶液を摂氏4度の湿度チャンバーで一晩、目的の一次抗体の60マイクロリットルと慎重に交換します。翌朝、PBS中のオービタルシェーカーでスライドを洗浄ごとに2分間洗浄し、その後、60マイクロリットルの適切な蛍光色素結合二次抗体を各スライドに加え、室温で40分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、示されているようにスライドをPBSで洗浄し、続いて0.3%スーダンブラックを70%エタノールで処理して、ホルマリン誘発性の自家蛍光の可能性を消光します。30分後、スライドを水道水で洗浄して沈殿物を取り除き、スライドをPBSに10分間浸漬して、スーダンブラック沈殿物のさらなる形成を防ぎます。

インキュベーションの最後に、DAPIを添加した360マイクロリットルのマウント溶液を共焦点ガラスカバーガラスにスライドを取り付け、カバーガラスをマニキュアで密封します。スライドを室温で24時間硬化させます。標準プロトコルに従って共焦点レーザー走査顕微鏡でイメージングするまで、光から保護された摂氏4度で保管します。