0 閲覧数 • 2:42 分 • April 30th, 2023
がんスフェロイドは、腫瘍細胞の三次元細胞凝集体です。これらのスフェロイドはコラーゲンマトリックスに埋め込まれ、スフェロイドブロックが形成されます。スフェロイドブロックを急速凍結するには、まずコラーゲンゲルスフェロイドブロックを組織型の中心に配置します。
ブロックを適切な緩衝液ですすぎ、金型に固定液を補充します。この溶液がスフェロイドに浸透し、細胞タンパク質を架橋するようにインキュベートします。このステップは、後続の手順のためにスフェロイド構造を維持するのに役立ちます。次に、固定液を吸引します。
スフェロイドゲルブロックを、包埋培地の薄層を含む新しい組織学型に入れます。さらに埋め込み媒体を重ねて、回転楕円体ブロックを完全に沈めます。最後に、金型を液体窒素浴に短時間浸します。
急速凍結により、回転楕円体内でより大きな氷の結晶が形成されるのを防ぎます。機械的損傷を引き起こすことなく、スフェロイドの完全性を維持するのに役立ちます。埋め込み培地層が回転楕円体ブロックの周囲で固まったら、凍結したブロックを金型から取り出します。凍結スフェロイドブロックを低温で保存し、さらなる組織学的分析を行います。
まず、小さな鉗子を使用して、コラーゲンゲルとスフェロイドのブロックをチャンバースライドから持ち上げます。次に、コラーゲンゲルブロックをプラスチックの組織型に入れます。コラーゲンゲルブロックを1X PBSで短時間すすぎ、室温で30分間PBS中の4%PFAで固定します。この後、コラーゲンゲルブロックを1.5ミリリットルの1X PBSでシェーカーで15分間洗浄します。
新しいプラスチック組織学型の底にOCTコンパウンドの薄層を塗布します。次に、固定して洗浄したコラーゲンゲルブロックをOCTコンパウンドの上に置き、金型の残りの部分にOCTコンパウンドを慎重に充填します。型を摂氏4度で1時間保ちます。この後、液体窒素に浮かべた100mmのペトリ皿で金型を急速凍結し、試料をマイナス80°Cで保存します。