マウス膀胱の尿路上皮へのDNAプラスミドの送達:マウス膀胱の尿路上皮細胞にDNAプラスミドを効率的に送達するためのエレクトロポレーションベースの手順により、遺伝子操作モデルを生成する

まず、麻酔をかけた雌マウスを仰臥位で準備します。膀胱が完全に空であることを確認してください。尿道口から、潤滑カテーテルを挿入します。潤滑は、膀胱に入るためのスムーズな尿道通過を助けます。

カテーテル挿入後、腹部を切開し、内側の筋肉組織を解剖して膀胱を露出させます。次に、適切な色素と混合したDNAプラスミドの懸濁液をカテーテルの外端にピペットで入れます。これらのDNAプラスミドは蛍光レポーター遺伝子をコードします。

注射器をカテーテルに取り付け、押してプラスミド溶液を膀胱に送ります。注入された色素分子は膀胱を着色し、プラスミド溶液の投与が成功したことを確認します。カテーテルアセンブリを取り外し、外尿道口を締めてプラスミド溶液の流出を防ぎます。

次に、エレクトロポレーション発生器に接続された2つの電極を使用して膀胱をつまみます。適切な電圧の電気パルスを希望の期間膀胱に印加します。膀胱の最も内側の内層である膀胱尿路上皮が印加された電界にさらされると、尿路上皮細胞膜に一時的な細孔が生じます。

膜透過性の向上により、注入されたDNAプラスミドを細胞内に効率的に送達することができます。エレクトロポレーション後、外科的切開部を縫合します。マウスが回復するまで待ちます。DNAプラスミドをトランスフェクトした尿路上皮細胞は蛍光レポータータンパク質を発現

する

トランスフェクトする各膀胱について、少なくとも20マイクロリットルのDNAプラスミドを1マイクロリットルあたり1マイクログラムで調製します。次に、1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の20マイクロリットルのプラスミド溶液に1マイクロリットルのトリパンブルーを加え、ピペットでよく混合します。プラスミドを送達するには、腹部に70%エタノールを塗布します。膀胱の上の腹部皮膚を開くために、1センチメートルの垂直切開を行います。

次に、筋肉層を切断して膀胱を露出させます。少なくとも20マイクロリットルのプラスミドとトリパンブルー溶液をカテーテルの外側の端にピペットで入れ、シリンジに取り付けます。次に、プラスミド溶液を膀胱に注入します。膀胱が青色に変われば注射は成功です。膀胱内に気泡が発生しないように、カテーテル内に液体を残してください。

その後、外尿道口をつかみ、カテーテルと注射器を取り外します。紐を使用して外尿道口を締めます。紐で2つのループを作り、2つの結び目で結びます。これは、2 人の協力が必要な重要なステップです。プラスミドが漏れないように、結び目がしっかりとしていることを確認してください。

次に、エレクトロポレーション発生器の電源を入れます。2つの電極で膀胱をつまみ、フットペダルを押してエレクトロポレーションを行います。膀胱を支えたままにするために、ピンセットで腹部切開部の裏側をつまむことができます。ピンセットと電極が接触すると火花が発生する可能性があるため、避けてください。

それが終わったら、腹部と皮膚の開口部を滅菌外科用縫合糸で縫合します。紐を外してクリップを適用します。ヨウ素を傷口に塗布し、イソフルラン系から動物を取り出します。ブプレノルフィン鎮痛薬を皮下投与して、術後の痛みを軽減します。動物を加熱パッドの上に置き、完全に回復したらホームケージに戻します。