エレクトロポレーションを用いたエキソソームへのsiRNAカプセル化:エキソソームにsiRNAをロードするための電気パルスベースの技術

エクソソーム(ナノサイズの細胞由来膜小胞)は、二本鎖低分子干渉RNAまたはsiRNAの治療送達媒体としての可能性を示しています。

標的細胞の細胞質に放出された後、siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体に結合します。活性化された複合体は、特定のmRNAを認識して結合し、その発現を負に調節し、遺伝子サイレンシングを媒介します。

siRNAをエクソソームにカプセル化するには、まずエレクトロポレーションキュベットを氷上で冷却します。次に、適切なエレクトロポレーションバッファーを使用して、エクソソームと特定のsiRNAをチューブ内で所望の比率で混合します。次に、この混合物を事前に冷やしたキュベットに移します。

キュベットを閉じて、エレクトロポレーターのキュベットホルダーに入れます。回転ホイールを回転させて、キュベットがエレクトロポレーション電極に接触していることを確認します。次に、選択したエレクトロポレーションプログラムを実行します。

エレクトロポレーション中、電気パルスは導電性バッファーに浮遊するエクソソームのリン脂質二重層を乱します。これにより、エクソソーム膜に一過性の細孔が形成され、小胞へのsiRNAの拡散が促進されます。このバッファーは、siRNAの凝集を防ぐのに役立ちます。

エレクトロポレーションが完了すると、細孔が再密閉され、siRNAが内部に閉じ込められます。最後に、エレクトロポレーターからキュベットを取り出し、混合物を新しいチューブに移します。siRNAカプセル化されたエクソソームは、さらに使用するまで低温で保管してください。

エレクトロポレーションを開始する前に、エレクトロポレーションキュベットを氷上で30分間予冷します。7マイクログラムのエクソソームと0.33マイクログラムのsiRNAを微量遠心チューブで混合します。クエン酸緩衝液を加えて、150マイクロリットルの容量にします。プラスチックピペットを使用してエクソソーム-siRNA混合物をエレクトロポレーションキュベットに加え、キュベットにキャップをかぶ

せます。

キュベットをエレクトロポレーターのキュベットホルダーに正しい向きに置き、エレクトロポレーターの回転ホイールを時計回りに180度回転させます。目的のプログラムを選択し、スタートボタンを押してエレクトロポレーションを開始します。ディスプレイは、パルスが成功したことを示します。

次に、ホイールを反時計回りに180度戻し、キュベットを取り外します。プラスチック製のピペットを使用して、キュベットから新しい微量遠心チューブにサンプルを取り出します。すぐに使用しない場合は、チューブを氷の上または冷蔵庫に保管してから、さらに処理してください。