逆相タンパク質アレイに基づくタンパク質発現解析:細胞溶解物からの複数のタンパク質の発現の同時定量化のための手順

腫瘍サンプルには、タンパク質の不均一な集団が含まれています。腫瘍溶解物を使用すると、複数のそのようなタンパク質を並行して分析して、目的のタンパク質を特定できます。このハイスループット技術は、逆相タンパク質アレイ(RPPA)と呼ばれます。

RPPAを実行するには、まずニトロセルロースでコーティングされたイムノアッセイスライドガラスを採取します。スライド上の腫瘍溶解物タンパク質の配列を見つけます。ニトロセルロースにタンパク質を捕捉できるようにインキュベートします。続いて、タンパク質上の非特異的抗体結合部位をブロックするブロッキングバッファーでスライドを処理します。

余分なブロッキング溶液を取り除きます。次に、タンパク質でコーティングされたスライドをホルダーに取り付け、しっかりと密封します。これにより、スライド表面に一時的な井戸が作成されます。次に、一次抗体溶液をウェルにロードします。これらの抗体は、アレイ上のタンパク質の混合物から、対応する標的に存在するエピトープを認識します。

最後に、蛍光標識二次抗体を加えます。これらの抗体は、事前に結合した一次抗体に結合して複合体を形成します。スライドを洗浄して、結合していない二次抗体を除去します。スライドをホルダーから外し、自然乾燥させます。

蛍光スキャナーを使用してスライドをスキャンします。抗体タグ付き標的タンパク質は特定の波長で蛍光を発し、スライド表面に色付きの斑点として現れます。

RPPA印刷の前に、各サンプルから5つの2倍希釈液を連続して作ります。この手順で最も時間のかかる側面の 1 つは、何百回も希釈することです。スライドを印刷する前に再確認することで、成功した結果を保証できます。

次に、MicroGrid IIロボットスポッターを使用して、ニトロセルロースでコーティングされたスライドガラス上のタンパク質ライセートを見つけます。各サンプルは 3 回に分けてスポットされ、サンプルごとに合計 15 個のスポットが得られます。この実験で使用したスライドには、サンプルがスポットされる2つのパッドが含まれています。各パッドには同一のサンプル、この場合は100個のサンプルが発見されました。その他の利用可能なフォーマットには、1、8、および16パッドスライドがあります。パッドの数が多いほど、それぞれに検出できるサンプルの数は少なくなります。

タンパク質検出の手順を開始するには、過剰なブロッキングバッファーを湿らせ、ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間インキュベートします。800マイクロリットルの一次抗体をブロッキングバッファーに所望の濃度で調製し、氷上に置いておく。ブロッキングバッファーで1時間インキュベートした後、スライドとインキュベーションチャンバーの間にしっかりとしたシールが形成されるように、シングルフレームチップクリップまたはFastFrame4ベイスライドホルダーのいずれかにスライドを取り付けます。

ウェルから残留バッファーを除去し、600マイクロリットルの一次抗体をそれぞれのウェルに加えます。スライドとチャンバーを密閉されたウェットボックスに入れ、摂氏4度のロッキングプラットフォームで一晩インキュベートします。翌朝、冷蔵室からスライドを取り外します。各ウェルから一次抗体を慎重に除去します。600マイクロリットルの0.1%PBS-Tween20またはPBS-Tを加え、室温のロッキングプラットフォーム上でスライドを5分間洗浄します。

PBS-Tを新しいPBS-Tと交換します。このように、ウォッシュスライドは合計3回行われます。ウェルからバッファーを取り出し、600マイクロリットルの蛍光標識二次抗体を適切な希釈液でそれぞれのウェルに加えます。二次抗体と室温で45分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。スキャンするまで、メンブレンを光から保護することが重要です。45分後、ウェルから二次抗体を除去し、室温で600マイクロリットルのPBS-Tで3回短時間洗浄します。

スライドをキャリアから取り出し、適切な容器に移し、メンブレンを暗所に保ちながら、余分なPBS-Tで15分間洗浄します。PBS-Tを除去し、メンブレンを室温でPBSで15分間洗浄して残留トゥイーン20を除去し、再びメンブレンを暗所に保ちます。ファストスライドを摂氏50度のオーブンで10分間乾燥させます。最後に、使用する二次抗体に応じて、スライドを680ナノメートルおよび/または800ナノメートルでスキャンします。