ゼブラフィッシュ胚へのネフロトキシンの静脈内マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュ胚の血流にネフロ毒性物質を送達する技術

静脈内マイクロインジェクションは、レシピエント動物の血流への目的の分子の送達を促進します。ネフロトキシンをゼブラフィッシュ胚に送達するには、まず、適切な濃度の所望のネフロトキシン溶液を調製します。

細かいゲルローディングチップを使用して、このネフロトキシン溶液を鋭利な角度のある先端を持つマイクロインジェクション針にロードします。針を垂直に吊り下げて、ネフロトキシン溶液が重力によって針先を満たすようにします。次に、ロードされたマイクロインジェクション針をマイクロマニピュレーターのホルダーに固定します。

いて、麻酔をかけたゼブラフィッシュ胚をプレハブのマイクロインジェクション金型に移します。型内の胚を、頭をウェル内に向けて、尾をウェルの外に向けるように位置合わせし、マイクロインジェクションのための尾へのアクセスを改善します。次に、針先を胚の近くに正確に配置します。

ネフロトキシン溶液を胚の尾静脈に注入します。注射された腎毒性物質は循環を通って広がり、腎臓などの遠くの臓器に到達します。針をゆっくりと引っ込めます。胚を胚培地を含む新鮮な皿に移し、回復させます。胚を特定の期間インキュベートします。

注射後数時間以内にネフロトキシンが腎臓に蓄積して損傷を引き起こし、腎機能の低下につながります。

注射当日に、適切なビヒクルコントロールを使用して目的のネフロトキシン溶液を調製します。ボルテックスまたは穏やかに混ぜます。その後、チューブの側面と水柱の上部をチェックして、薬剤が溶液に溶解していることを確認します。

細いゲルローディングチップを針の裏側に通して、トリミングしたマイクロインジェクション針に2〜3マイクロリットルのネフロトキシンをロードし、テープで針を垂直に吊り下げて、溶液が重力によってトリミングされた針の先端を満たすようにします。

針先がいっぱいになったら、ロードされた針をマイクロマニピュレーターに固定します。マイクロメーターのスライドに鉱物油を一滴垂らしてマイクロインジェクション量をテストし、オイルに注入して液滴サイズを評価します。

次に、胚の皿をインキュベーターから取り出し、胚皿に5ミリリットルの0.2%トリカインを加えて麻酔します。その後、トランスファーピペットを使用して胚を射出成形金型に移します。各胚を型の異なる井戸に操作し、幹がくぼみに沿って置かれ、尾がそこから突き出るように頭を井戸の最も深い領域に置きます。

次に、充填した針をマイクロマニピュレーターに挿入し、針先を胚の隣に置きます。マイクロインジェクションのために尾静脈に針をそっと挿入します。

手順の最も重要なステップはマイクロインジェクションです。確実に成功するには、針を鋭角に切断し、胚の隣の位置に慎重に移動させる必要があります。

注射が成功すると、液体が循環に入るのがわかります。腎毒性物質と蛍光結合デキストランを同時注射することで、研究者は処置後に注射が成功したことを確認できるようになります。その後、胚から針をそっと取り除きます。

胚を清潔な皿に移し、すすぎ、新鮮なE3 / PTUでトリカインを取り除きます。次に、胚を目的の時点までインキュベートして形態を評価し、メチルセルロース封入培地での写真撮影によって記録するか、必要に応じて実験分析のプロセスを行うことができます。

胚の回復は、注射後12〜24時間ごとに評価して、一般的に腎障害を示す浮腫のある個人の割合を決定する必要があることに注意してください。