ゼブラフィッシュ腎臓の色素脱失と染色:成体ゼブラフィッシュ腎臓の染色準備技術

ゼブラフィッシュの成体の腎臓は、魚の背側体壁に隣接する半透明の構造です。腎臓は、散在したメラノサイト(腎幹細胞を有害な紫外線から保護する特殊な細胞)に対応する表面の黒い斑点の存在を示します。

腎臓を脱色して染色の準備をするには、安楽死させた成体のゼブラフィッシュを服用することから始めます。ゼブラフィッシュ全体を適切な固定液に浸し、所望の時間インキュベートします。インキュベーションにより、固定液が魚の体に浸透し、組織成分を所定の位置にロックします。

次に、ゼブラフィッシュを腹側に置き、頭を取り除きます。頭部の下から尾びれまで長い腹側切開を行います。臓器を切除して下にある腎臓を露出させます。鉗子を使用して、腎臓を背壁から切り離し、ガラスのバイアルに入れます。

解剖

された腎臓をスクロース溶液の濃度を上げて治療します。ショ糖溶液は、腎臓の収縮を防ぐ等張環境を作り出します。その後、腎臓を漂白液でインキュベートしてメラノサイトの色素沈着を除去します。これは、さらなる染色手順中に腎臓をよりよく視覚化するのに役立ちます。

最後に、漂白液をブロッキング液に交換して、不要な部位をブロックし、非特異的な染色を防ぎます。脱色した成体のゼブラフィッシュ腎臓は、その後の染色ステップの準備が整いました。

準備ができたら、細い鉗子を使用して腎臓を体背壁から慎重に切り離し、臓器をガラスのバイアルに入れます。解剖した腎臓を3〜5ミリリットルの1x PBSと0.05%トゥイーンでそれぞれ5分間洗浄します。

次に、PBS溶液を取り出し、3ミリリットルの5%スクロース溶液で腎臓を30分間すすぎます。この後、溶液を3ミリリットルの30%スクロースと交換し、摂氏4度で一晩保存します。

翌日、溶液を取り出し、腎臓を2回洗浄してから、3〜5ミリリットルの漂白液を加えて、腎臓器に存在するメラノサイトの色素沈着を除去します。ガラスバイアルを回転子の上に置き、色素沈着が消えるのを注意深く観察します。色素脱失には通常約 20 分かかりますが、場合によっては 60 分もかかることもあります。

漂白液を長時間放置すると崩壊が発生する可能性があるため、サンプルを10〜15分ごとに監視して組織の完全性を確認することをお勧めします。腎臓から色素沈着が除去されたら、2回洗浄し、室温で4%PFA溶液と1時間インキュベートします。

次に、4%PFA溶液を取り出し、腎臓を3回洗浄します。最後の洗浄後、3〜5ミリリットルのブロッキング溶液を加え、腎臓を室温で2時間インキュベートします。ブロッキングが完了したら、選択した染色プロトコルに直接進みます。